丁苯酞对脑瘫大鼠PI3K/Akt信号通路及海马神经元凋亡的影响

袁琳 李洁 王芳 李可

(1苏州市中西医结合医院老年科，江苏 苏州 215101；2徐州医科大学附属医院神经内科监护室)

脑性瘫痪(脑瘫)是一种神经发育障碍性脑损伤疾病，其主要临床特征是肌张力、运动和运动技能异常〔1,2〕，研究报道，我国脑瘫患病率为5.40%〔3〕。因此研究脑瘫的发病机制，对其临床治疗有重要意义。研究表明，凋亡是神经细胞发育和自然死亡的重要过程，凋亡机制紊乱会引起缺血性脑血管病、帕金森病等多种神经疾病的发生〔4,5〕，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是组织细胞内的中央网络，调节细胞增殖、迁移和凋亡，并参与调控神经元细胞信号的传导〔6〕。丁苯酞是一种具有抗脑缺血作用的药物，能够有效治疗脑梗死、缺血性脑血管疾病〔7,8〕。然而，丁苯酞在脑瘫中的作用研究报道较少，本研究通过观察丁苯酞对脑瘫大鼠的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF清洁级SD大鼠75只，8周龄，体重约为250 g，由北京生命科学研究所动物实验中心提供，合格证号为SYXK(京)2015-0002，适应性饲养1 w后，进行后续实验。本研究经医院动物伦理委员会批准同意。

1.2试剂及仪器 丁苯酞(货号： hzm2479)购自上海沪峥生物科技有限公司；苏木素染液(货号：G1080)、伊红染液(货号：G1100)购自北京索莱宝科技有限公司；TUNEL试剂盒(货号：C1086)购自碧云天生物技术研究所；PI3K抗体(货号：ab32089)、AKT抗体(货号：ab38449)、p-AKT抗体(货号：ab8805)、GAPDH抗体(货号：ab181602)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体(货号：ab182858)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体均购自美国abcam公司；p-PI3K抗体(货号：XGK0788)购自上海西格生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的二抗(货号：BHR101)购自北京博尔西科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒(货号：P0010S)购自上海碧云天公司；蛋白电泳及电转移装置(型号：AU5800)购自北京市六一仪器厂；酶联免疫分析仪(型号：EVO75)购自澳大利亚Techan公司；超低温冰箱(型号：MDF-U32V)购自美国Thermo公司。

1.3实验方法

1.3.1脑瘫大鼠模型构建及分组 将75只SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、丁苯酞低、中、高剂量组各15只。丁苯酞低、中、高剂量组：腹腔分别注射丁苯酞20、40、80 mg/(kg·d)；假手术组、模型组：腹腔注射等量生理盐水，连续注射3 d。末次给药2 h后，参考文献〔9〕制备脑瘫大鼠模型：除假手术组外，其余大鼠用10%水合氯醛(4 ml/kg)进行麻醉，在颈部钝性分离左侧颈总动脉，用0号线进行结扎，迅速缝合伤口，大鼠自然苏醒后，将其置于封闭的缺氧箱中，箱中通入92%氮气+8%氧气的混合气体，维持2 L/min的流速，箱内温度37℃，2 h后取出大鼠进行后续实验，假手术组大鼠仅钝性分离左侧颈总动脉，不结扎，其他干预与模型大鼠相同。本研究模型构建成功率为100%。

1.3.2各组神经功能缺损评分 术后24 h后，参考文献〔10〕对各组神经功能缺损进行评分：0分，大鼠行为正常；1分，大鼠右前肢伸展不完全；2分，大鼠行走过程中转圈；3分，大鼠行走中出现倾倒；4分，大鼠意识丧失，无行走能力。重复评定3次，取平均值作为最终评分，评分在1～3分说明模型制备成功。

1.3.3苏木素-伊红(HE)染色观察各组海马区组织病理变化 各组神经功能损伤评分后，每组取5只大鼠，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，处死大鼠，分离脑组织，用4%多聚甲醛固定，做常规石蜡切片，海马吻合位置连续冠状切片(4 μm)。用HE染色，每张切片选取5个视野，光学显微镜下观察脑组织海马区病理学改变。

1.3.4TUNEL染色观察海马区神经元细胞凋亡情况 每组选取5只大鼠，同1.3.3方法分离脑组织，将海马组织切片，于二甲苯、不同浓度乙醇中浸泡5 min后，用蛋白酶K室温消化1 h后，按TUNEL试剂盒说明书将切片进行染色、终止反应、封片等，于荧光显微镜下观察细胞凋亡数目。经TUNEL染色的阳性细胞呈棕黄色或棕褐色，细胞凋亡率=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%。

1.3.5Western印迹检测各组海马区Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达 提取海马组织总蛋白，BCA法测其浓度，按蛋白30 μg /孔上样进行电泳分离、转膜、封闭后分别加入一抗(抗Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GAPDH抗体，1∶1 000)，4℃下过夜培养，次日加二抗(1∶5 000)，温室中培养1 h，洗膜，电化学发光(ECL)法进行显色，用GAPDH作内参，扫描胶片，Tanon600图像分析系统分析条带灰度值。

1.4统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组神经功能缺损评分 与假手术组〔(0.00±0.00)分〕相比，模型组神经功能缺损评分〔(2.78±0.29)分〕显著升高(P<0.05)；与模型组相比，丁苯酞低、中、高剂量组神经功能缺损评分〔(2.42±0.26)分、(2.40±0.25)分、(1.73±0.19)分〕显著降低(P<0.05)；与丁苯酞低、中剂量组相比，丁苯酞高剂量组神经功能缺损评分显著降低(P<0.05)。

2.2各组海马区组织病理变化 假手术组海马区细胞饱满、排列紧密、结构清晰；与假手术组相比，模型组海马区细胞排列稀疏紊乱、胞体减小、出现细胞核破裂现象；与模型组相比，丁苯酞低、中、高剂量组海马区细胞上述病理症状明显减轻。见图1。

2.3各组海马区神经元凋亡的影响 与假手术组〔(3.24±0.25)%〕相比，模型组海马区细胞凋亡率〔(30.18±2.43)%〕显著升高(P<0.05)；与模型组相比，丁苯酞低、中、高剂量组海马区细胞凋亡率〔(22.36±2.65)%、(21.45±2.12)%、(16.13±1.73)%〕显著降低(P<0.05)；与丁苯酞低、中剂量组相比，丁苯酞高剂量组海马区细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图2。

图1 各组海马组织HE染色(×200)

图2 各组海马神经元凋亡TUNEL染色(×200)

2.4各组海马区Bax、Bcl-2蛋白表达 与假手术组相比，模型组海马区Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与模型组相比，丁苯酞低、中、高剂量组海马区Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)；与丁苯酞低、中剂量组相比，丁苯酞高剂量组海马区Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图3、表1。

2.5各组海马区PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达 与假手术组相比，模型组海马区p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低(P<0.05)；与模型组相比，丁苯酞低、中、高剂量组海马区p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著升高(P<0.05)；与丁苯酞低、中剂量组相比，丁苯酞高剂量组海马区p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表1、图4。

1～5：假手术组，模型组，丁苯酞低剂量组，丁苯酞中剂量组，丁苯酞高剂量组；图4同图3 各组海马区Bax、BcL-2蛋白表达

表1 各组海马区Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达比较

图4 各组海马区PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达

3 讨 论

近年来，脑瘫的患病率逐年上升〔11〕。脑瘫是由于缺氧缺血而导致大脑损害引起的，造成肢体残疾，严重影响其生活质量〔12,13〕。因此，研究脑瘫的病因及病理特征，有利于其临床诊治。本研究结果与赵鹏举等〔14〕研究结果一致，提示脑瘫大鼠模型构建成功，脑瘫引起大鼠神经功能缺损。丁苯酞是芹菜挥发油的主要成分，对缺血性脑损伤疾病有较好的治疗作用，江玲军等〔15〕研究显示，丁苯酞对脊髓损伤大鼠神经运动功能具有保护作用。袁齐宏等〔16〕研究显示，丁苯酞预处理可改善脑缺血再灌注大鼠神经功能，达到较好的脑保护作用。本研究结果提示丁苯酞可以改善脑瘫大鼠病理症状，减轻其神经功能损伤。

神经细胞凋亡与脑瘫的发生、发展密切相关。Bax是一种促凋亡因子，Bcl-2是抑凋亡因子，共同调控细胞凋亡过程〔17〕。本研究结果与王新琳等〔18〕研究结果一致，提示脑瘫引起神经细胞凋亡增加与Bax、Bcl-2蛋白表达有关。鲁玉霞等〔19〕研究显示，通过下调Caspase-3、Bax mRNA及蛋白、上调Bcl-2 mRNA及蛋白，可以减少大脑皮质神经细胞凋亡。陈晓莉等〔20〕研究显示，丁苯酞通过抑制凋亡因子蛋白表达从而抑制细胞坏死性凋亡，减轻小鼠脑缺血再灌注损伤。本研究结果提示丁苯酞可以促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，从而抑制神经细胞凋亡，减轻脑瘫大鼠神经功能损伤。

PI3K/Akt信号通路是抗凋亡通路。Zhang等〔21〕研究显示，调节PI3K/Akt信号通路可以抑制海马神经元凋亡，改善脑瘫大鼠相关的缺陷。刘红欣等〔22〕研究显示，PI3K/Akt信号通路参与电针刺激头部运动区对脑瘫鼠脑损伤区神经生长相关蛋白的调控，在促进神经功能康复的作用机制中发挥重要作用。本研究结果提示，PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达与脑瘫发生有关。Cho等〔23〕研究显示，激活PI3K/Akt信号通路，可以抑制海马细胞凋亡，改善脑瘫大鼠短期记忆。本研究结果提示，丁苯酞可以促进PI3K、Akt磷酸化蛋白表达，推测丁苯酞可能通过促进PI3K/Akt信号通路激活，促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，从而抑制神经细胞凋亡。

综上，丁苯酞可能通过激活PI3K/Akt信号通路，调控凋亡相关因子表达，抑制脑瘫大鼠海马神经元细胞凋亡，改善脑瘫大鼠病理症状，减轻其神经功能损伤，但由于本研究未对特异性干预通路进行验证，其具体作用机制有待后续研究。