极低频电磁场对局灶性脑缺血大鼠神经功能缺失恢复的影响及机制

欧阳葵 梁培日 吴挺国 周德聪 陈增 周经霞

(1海南省干部疗养院(海南省老年病医院)，海南 海口 571100；2海南医学院第二附属医院)

缺血性脑卒中患者多发于老年人群，具有很高的复发率、致残率、死亡率，极大影响患者的生命安全和生活质量〔1〕。脑损伤后导致大脑皮质运动区神经元死亡，突触结构异常导致神经递质释放功能障碍引起一系列症状，包括认知功能障碍、运动功能障碍等，还包括大脑皮层、海马等部位胆碱能神经元的缺失和功能异常〔2〕。电磁场的生物效应实验提示，生命体与低频电磁场表现出关联性、协同性及与频率时间相关的特性〔3〕。近年来实验报道了稳恒磁场和中频、高频电磁场对细胞、组织、活体的影响〔4〕。但在缺血性脑卒中后受损的中枢神经系统恢复中作用的研究仍十分少见。本研究旨在探讨极低频电磁场对局灶性脑缺血大鼠神经功能缺失恢复的影响及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 清洁级成年SD雄性大鼠180只，7～8 周龄，体重250～280 g，购于海南省医学实验动物中心，许可证号：SYXK(琼)2017-0013。适应性喂养7 d后，随机分为对照组(假手术)、模型组(局灶性脑缺血模型)、极低频电磁场治疗组，每组60只。根据实验设计将上述3组进一步随机分为6个亚组，分别为治疗前及治疗后3、7、14、21、30 d，每个亚组10只。

1.2主要试剂与仪器 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于上海翌圣生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、过氧化氢酶检测试剂盒均购于南京诺尔曼生物技术有限公司。HR-6型手持高速匀浆机购于上海沪析实业有限公司；水迷宫购于上海基尔顿生物科技有限公司；CX43型光学显微镜购于奥林巴斯(中国)有限公司。

1.3大鼠局灶性脑缺血模型制备 采用大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO)模拟脑缺血再灌注损伤。大鼠麻醉进行气管插管和机械通气，颈部正中皮肤切开，钝性分离暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和劲内动脉分盆口处，电凝器夹闭甲状腺上动脉，临时结扎翼腭动脉，结扎颈外动脉远心端，以动脉夹临时夹闭颈总动脉和颈内动脉，于颈外动脉上做一切口，插入硅胶头线栓，沿颈外动脉进入颈内动脉，到达大脑中动脉起始部后开始计时缺血时间，随后固定线栓，放开颈总动脉和翼腭动脉并缝合切口，待大鼠清醒后拔除气管导管。缺血60 min后，完全拔出线栓，待大鼠清醒后放回笼中喂养。对照组除不插入线栓外，其余步骤同手术组。

1.4极低频电磁场刺激方案 磁场装置运行期间磁场环境均匀稳定，电磁场频率固定为5 Hz，磁感应强度为0～140 mT连续可调。在大鼠标准评估结束后，将极低频电磁场治疗组暴露磁感强度调为140 mT，暴露时间为5 h，连续暴露30 d。在电磁场中，大鼠的活动不受任何限制。暴露到电磁场前后分别测量大鼠温度，暴露在电磁场中引起的肛温上升不超过0.2℃。对照组和模型组不进行极低频电磁场暴露。

1.5水迷宫实验 各亚组在相应时间点进行水迷宫实验，首先进行2次训练，第1次训练将大鼠放入水池边缘，计时180 s，到时间后若仍未上到平台，则主动将大鼠置于平台上10 s，之后放入笼中静置5 min，进行第2次培训，方法同第1次。培训结束后5 min进行检测，记录上到平台的时间，若180 s仍未上到平台则将时间记录为180 s。

1.6标本采集与处理 各亚组水迷宫实验结束1 h后，全麻后断头处死，其中5只取出全部脑组织后立即称重(湿重)，之后放入烤箱中100℃烘干24 h并称重(干重)，计算脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。另外5只脑组织取出后一半放入多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋用于海马CA1区凋亡阳性神经元检测；另外一半脑组织放入生理盐水中洗去残血，滤纸吸干，按1∶5比例经冷的生理盐水，使用手持组织匀浆机12 000 r/min匀浆2 min，5 000 r/min、4℃恒温离心10 min，收集上清液，-20℃保存，6 h内完成检测。

1.7大鼠海马CA1区神经元凋亡情况检测 取大鼠脑组织蜡块，置于大鼠脑模中切取海马位置，5 μm连续切片，放于明胶包被的显微镜载玻片上，自然风干，使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行测定，在高倍镜(×400)视野下观察并拍照，使用Image J软件计数海马CA1区凋亡阳性神经元数目。

1.8大鼠脑组织SOD、丙二醛、过氧化氢酶水平检测 取治疗前和治疗后30 d大鼠脑组织匀浆，黄嘌呤氧化酶法测定SOD水平，硫代巴比妥酸反应物法测定丙二醛水平，过氧化氢与乙酸-重铬酸钾反应显色比色法测定过氧化氢酶水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.9统计学分析 使用SPSS25.0统计学软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1不同时间点各组学习记忆能力比较 治疗前模型组和极低频电磁场治疗组达到高台所需时间明显长于对照组(P<0.01)；而两组差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后极低频电磁场治疗组达到高台所需时间明显短于治疗前和模型组(P<0.01)；其中治疗后3、7、14、21 d随着治疗时间的延长大鼠达到高台所需时间逐渐缩短。见表1。

表1 不同时间点各组学习及记忆能力比较

2.2不同时间点各组脑组织含水量比较 治疗前模型组和极低频电磁场治疗组脑组织含水量明显高于对照组(P<0.01)；而两组差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后极低频电磁场治疗组脑组织含水量明显低于治疗前和模型组(P<0.05)；随着治疗时间的延长大鼠脑组织含水量逐渐减少。见表2。

表2 不同时间点各组脑组织含水量比较

2.3不同时间点各组海马CA1区凋亡阳性神经元数目比较 治疗前模型组和极低频电磁场治疗组大鼠海马CA1区凋亡阳性神经元数目明显高于对照组(P<0.01)；而两组差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后极低频电磁场治疗组海马CA1区凋亡阳性神经元数目明显低于治疗前和模型组(P<0.01)；随着治疗时间的延长大鼠海马CA1区凋亡阳性神经元数目逐渐减少。见表3，图1。

表3 不同时间点各组海马CA1区凋亡阳性神经元数目比较(个，

图1 不同时间点各组海马CA1区凋亡阳性神经元(TUNEL染色，×400)

2.4各组脑组织匀浆中SOD、丙二醛、过氧化氢酶水平比较 治疗前模型组和极低频电磁场治疗组脑组织匀浆中SOD、过氧化氢酶水平明显低于对照组，丙二醛水平明显高于对照组(P<0.05)；而两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后30 d极低频电磁场治疗组SOD、过氧化氢酶水平明显高于模型组，丙二醛水平明显低于模型组(P<0.05)。见表4。

表4 各组脑组织匀浆中SOD、丙二醛、过氧化氢酶水平比较

3 讨 论

兴奋在神经元上以电信号形式传导在大脑信息处理中发挥重要作用，动作电位阈下电流或弱电场会影响神经细胞活性〔5〕。近年来研究发现，体外培养的大脑皮质锥体细胞和脑片对外加弱电场有明显反应〔6〕。弱电场或磁场能够敏感地调节锥体细胞脑电振荡和放电频率，可推测阈下电磁刺激能够诱发神经元的去极化或超极化，改变兴奋性〔7〕。外加电场在颅内直接形成电场的同时，产生诱发电流能够影响脑组织中神经元的兴奋性〔8〕。体内的神经元与体外培养的神经元相比活性更强，且处于神经网络中，相互间联系紧密，对于诱发电流的敏感性更高〔9〕。合理使用弱电场对大脑的影响，可能成为一种保护神经功能，促进神经康复的重要手段。缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，具有很高的致残率和致死率，通过科学的治疗手段预防和改善缺血性脑卒中后继发的多种功能障碍问题，降低后遗症发生率，对提高患者生活质量，促进神经功能恢复具有重要意义。

本研究参考大鼠脑电生理频率设定电场刺激频率，进行体外极低频电磁场刺激，结果提示局灶性脑缺血后大鼠的学习记忆能力明显降低；极低频电磁场治疗能够有效提升局灶性脑缺血后大鼠的学习记忆能力。本研究结果显示，极低频电磁场治疗能够明显降低局灶性脑缺血大鼠脑组织含水量并延长低含水量的持续时间，避免严重脑水肿的发生。可能原因为，极低频电磁场改变了血液流变特征和离子流动方向，诱发血管扩张和血流速增加，改善局部微循环，促进血脑屏障的恢复。海马是大脑半球皮质内侧缘部分，是研究学习记忆能力的重要位置；CA1区是大脑海马区的重要组成部分，CA1区神经元参与对空间信息的编辑、加工，是学习记忆能力的主要负责区域之一，当神经元受到刺激启动细胞凋亡程序后，随着凋亡数量的增加可能出现记忆力下降、老年痴呆等〔10〕。本研究结果显示，极低频电磁场治疗能够明显降低局灶性脑缺血大鼠海马CA1区凋亡阳性神经元数目，有利于改善学习记忆能力。

缺血性脑损伤是多种因素共同作用的结果，其中氧自由基损伤是重要因素之一〔11〕；脑缺血再灌注过程中大量生成氧自由基和脂质过氧化物，破坏了膜脂质结构和酶蛋白微环境，同时自由基还能够诱发酶蛋白结构改变，造成酶活性丧失〔12〕。脑缺血时会大量生成自由基，激活过氧化反应，进而破坏膜蛋白质结构。SOD是人体中具有氧自由基清除活性的金属酶，在维持氧化和抗氧化平衡中发挥关键作用〔13〕。过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气〔14〕。丙二醛是自由基的降解产物，能够反映自由基水平，脂质过氧化产物中其对膜蛋白有很强的破坏作用；同时丙二醛还能够与部分多肽和蛋白质相互作用，阻碍细胞正常代谢，引发神经细胞损伤〔15〕。本研究结果提示局灶性脑缺血大鼠脑组织中SOD、过氧化氢酶低表达，丙二醛高表达；极低频电磁场能够有效升高大鼠脑组织中SOD、过氧化氢酶表达，降低丙二醛表达，进而改善内源性抗氧化系统功能，减少海马神经细胞损伤，促进神经功能缺失恢复。