急性心肌缺血对小鼠大脑血流灌注量影响的实验研究

戴明慧，王静雅，吴军尚，崔 帅

0 引 言

急性心肌缺血(acute myocardial ischemia, AMI)是由于冠状动脉突然阻塞不通，造成局部组织持续性缺血缺氧，进而引发心律失常、心肌梗死等疾病，是临床心血管疾病最常见的症状之一[1]。近年来，随着“心脑一体化”的理念被越来越多的人所重视和关注，对于心与脑之间生理、病理关系的研究成为热点。现代科学认为，“心-脑”之间的相互影响主要集中在2个方面：一是中枢神经系统对心脏的调控；二是心脏作为循环系统中最重要的器官对脑部供血的影响[2]。发生急性心肌缺血时，心脏功能指标迅速恶化所引起的脑血流灌注量的改变可能对脑功能产生很大影响。因此，本研究采用激光散斑血流成像与心脏超声技术配合血管舒缩物质的检测，观察比较正常与急性心肌缺血小鼠心脏功能、脑血流灌注量和心脏、脑组织ET-1和CGRP含量的变化，提示小鼠因急性心肌缺血诱发的脑血管低灌注的症状，从而证明“心-脑”之间联系的重要性，为临床“心脑共病”理论提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组选取6～8月龄，清洁级雄性C57BL/6J野生型小鼠60只。小鼠体重25～33 g，由广州中医药大学动物实验中心提供[实验动物证号：44005800008103，动物许可证号：SCXK(粤)20130034]。康为 IR60 独立送风隔离笼具饲养，笼内温度控制在(23±1)℃，相对湿度 60 %。自然进食，每12小时交替照明，适应性饲养 1 周。根据实验设计，采用完全随机法将小鼠分成正常组和AMI组。检测心超指标时，每组10只；检测脑血流指标、ET-1和CGRP含量时，每组6只。动物使用严格遵循广州中医药大学实验动物中心和华南针灸研究中心实验科研动物使用守则。

1.2主要试剂与仪器异氟烷(深圳瑞沃德生物技术有限公司)，阿氟丁(1.25 %, 美国Sigma, Sigma-Aldrich)。小动物呼吸机(ALC-V8-SL上海奥尔科特生物科技有限公司)，8-0医用非吸收缝合线(扬州市金环医疗器械厂)，小动物彩色超声成像系统(VeVo2100，加拿大Visual Sonics Inc)，激光散斑血流成像系统(PERIMED，瑞典PIMsoft)，ET-1、CGRP酶联免疫吸附剂测定试剂盒(南京建成)。

1.3模型制备方法采用经典冠状动脉左前降支结扎法制备心肌缺血小鼠模型[3]。1.25 %阿氟丁(80 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，将小鼠仰卧位置于恒温电热毯上，行气管插管并连接小动物呼吸机。呼吸机参数：呼吸频率90 次/min，潮气量1.8 mL。脱毛膏脱去胸部毛发，寻找左侧第3至4肋间，用剪刀在左锁骨中线纵行切口 1 cm，胸部左侧 3、4 肋间钝性分离肌层，放入定制的肋骨撑开器固定，以暴露手术视野。剥离心包膜后，寻找左心耳根部下缘 1～1.5 mm找到冠状动脉左前降支，从其下穿“8-0”无损伤缝合线，结扎左冠状动脉前降支，观察局部结扎心肌处逐渐缺血变白。手术结束后，用碘伏进行创面消毒并逐层缝合胸腔，待小鼠呼吸、心率平稳后，撤掉呼吸机和气管插管。同时心电图标准Ⅱ导联提示ST段抬高(≥ 0.1 mV)为模型复制成功的标准。

1.4检测方法与观察指标1% 异氟烷维持麻醉状态，将小鼠固定在超声检测台。将适量耦合剂均匀涂抹在左侧胸骨旁，并通过小动物超声探头获取小鼠左心室长轴与短轴切面，观察心电图波形和心率变化，保证心率维持在检测范围，测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)，左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shorting，LVFS)，每搏输出量(stroke volume, SV)和心输出量(cardiac output，CO)，通过检测连续3个心动周期，取平均值比较组间差异。

激光散斑血流成像测定小鼠全脑血流量，将小鼠固定在脑立体定位仪。1 %异氟烷维持麻醉，备皮并暴露颅骨表面。激光十字交叉点照射至前囟与后囟连线的中点，调整焦距后并开始采集全脑的血流灌注量，每只老鼠记录50 s。记录完毕后，选择目标区域(ROI=100 mm2)以保证所统计的血流灌注量不受周围毛发和皮肤的影响。

心肌组织和脑组织中ET-1和CGRP含量的测定，取心肌组织和脑组织匀浆液严格按照试剂盒说明操作，采用ELISA方法测定ET-1和CGRP含量。

2 结 果

2.1 心脏功能指标的比较心电图显示，AMI组小鼠较正常小鼠，ST段显著提高。见图1。2组小鼠在整个心脏超声记录过程中心率稳定，组间差异无统计学意义(P>0.05)，符合心脏超声操作对组间比较的要求。通过选择3个心动周期数据比较发现，AMI组小鼠较正常组，LVEF、LVFS、每搏输出量和心输出量均显著性降低(P<0.001)，提示急性诱发的心肌缺血能够引起心脏功能的改变。见图2。

a:正常组; b:AMI组

*P<0.001

2.2全脑血流灌注量的比较结果观察发现，AMI组小鼠脑血流灌注量明显低于正常组小鼠(P<0.001)，提示AMI能够诱发小鼠脑血管低灌注的症状，见图3。

*P<0.001

2.3心肌组织、脑组织中ET-1和CGRP的含量变化利用ELISA试剂盒检测观察，发现AMI组小鼠心肌组织、脑组织中的ET-1含量明显升高(P<0.01、P<0.05)；CGRP含量有下降趋势，但差异无统计学意义不具有统计学意义(P>0.05)，提示AMI小鼠的血管收缩力增加，可能引起脑血流的低灌注。见图4。

*P<0.05、**P<0.05

2.4相关性分析两组小鼠心肌组织、脑组织中ET-1、CGRP和脑血流灌注量进行相关性分析，发现小鼠心肌组织的CGRP与脑组织的CGRP呈正相关(R2=0.499 8,P<0.01)，心肌组织的ET-1与脑组织的ET-1呈正相关(R2=0.603 9,P<0.01)，说明脑组织中的低血流灌注量可能由急性心肌缺血诱发所导致。脑组织ET-1含量与脑血流灌注量呈负相关，CGRP含量与脑血流灌注量呈正相关(R2=0.231 9,P<0.05；R2=0.265 8,P<0.05)，说明急性心肌缺血可能降低外周心脏ET-1含量，提高中枢大脑CGRP含量变化，发挥改善因急性心肌缺血诱发所引起的脑血流低灌注的症状，见图5。

图5 小鼠ET-1、CGRP和脑血流灌注量线性相关与回归性分析散点图

3 讨 论

心脑一体主要体现在心、脑2个器官在生理和病理方面的相互作用。一直以来，心脏对脑的影响主要通过心脏的泵血作用，将养分和氧气运送到全身，从而维持人体正常的生命活动。适当的血流灌注是维持正常组织器官功能所必需的，它取决于几个因素，包括心输出量、血容量、全身血压和局部血管舒缩的自主调节，所有这些因素都与代谢需求密切相关[4-5]。与其他器官不同，大脑的存储能力有限，代谢活动很高，因此需要持续的氧气和营养供应[6]。有研究证实，尽管大脑只占整个身体重量的2 %，但接受了约12 %的心输出量[7]。在所有的哺乳动物的心肌梗死后，缺血心脏主要经历了3个阶段的结构和功能重构：炎症阶段(1～3 d)；肉芽组织阶段(1～7 d)；成熟/伤口愈合阶段(若干周)[8-9]。脑血流灌注量与心肌梗死后的心脏重构、功能分期以及相关的全身代偿机制直接相关。但脑血流灌注量的调节机制不能在低心功能和心肌缺血的炎症条件下恢复完整的脑供血[10]。这些发现强调了在脑、心脏进行适当治疗干预的重要性，包括调节血管舒缩功能、提高心脏功能和炎症消退等，进而恢复心肌缺血后的脑血流，防止大脑因低灌注量而出现潜在的急性或时间依赖性脑损伤。

ET和CGRP是与血管舒缩功能调控密切相关的、作用完全相反的一类神经多肽，调节两者的动态平衡对于维持心血管系统的正常生理功能至关重要。ET-1是强力的内源性血管收缩肽，对动脉有强烈的收缩作用，以冠脉最为敏感[11]。而CGRP是由降钙素基因表达的活性多肽，是体内最强的舒血管神经肽，分布广泛，尤其对脑、心血管的作用显著，并具有拮抗ET的作用[12]。

本研究结果提示急性心肌缺血后，心肌和脑组织中的ET-1含量均显著增加，但CGRP含量降低较少。说明急性心肌缺血后，冠状动脉狭窄或阻塞引起心肌组织缺血受损，导致血管内皮功能出现障碍，ET-1异常增加，从而进一步引起血浆中的ET-1水平升高，进入循环并影响脑内ET-1的含量变化，使脑血管出现暂时性收缩，导致大脑血流低灌注的状态。线性相关与回归分析显示脑血流灌注量与心脏功能(LVEF、LVFS、SV和CO)呈正相关，脑内ET-1的含量呈负相关，也证明了这一点。有研究报道，CGRP可拮抗ET的作用，抑制钙内流，减轻心肌损伤[13]；但由于心脏急性的心肌缺血，造成心肌中高浓度的ET-1迅速增加，CGRP对心肌组织与脑组织的保护作用减弱，ET-1对心肌的负性作用增强，打破了ET与CGRP的动态平衡，导致外周心肌与中枢脑组织ET-1与CGRP的平衡失调，并随着血液循环到达大脑，引起大脑暂时性的血流低灌注状态。

急性心肌缺血可以继发脑血管供血不足导致的脑缺血，脑缺血之后可能再会继发心肌损伤，这是临床上心肌缺血治疗中不可忽视的问题。本实验结果强调了急性心肌缺血早期脑血流量受损的重要性及其对脑血管预后的潜在影响，也证明了在心脑一体化的理念下，急性心肌缺血早期干预以恢复正常脑血流量的重要性，为临床防治心脑血管疾病提供更多的理论依据，值得进一步深入研究。