Hsa_circ_0016600/miR-1298/TGFA轴促进人肺腺癌细胞增殖和迁移的作用机制

曹碧月，王慧敏，王亚东，邹晓莉，王雪君，严玉兰

0 引 言

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，而肺腺癌则为其最常见的类型，其发病率逐年上升[1-2]。有研究表明肺癌的5年总生存率仍不足20%[3-4]。因此，急需寻找新的方法来改善肺癌的治疗效果。

环状RNA(circRNA)的结构呈闭合环状，具有稳定性和保守性[5]。研究表明，circRNA与肿瘤进展相关，并有望成为肿瘤新型治疗靶点[6-7]。如circPDHX促进前列腺癌的增殖和侵袭[8]。circCAMSAP1促进骨肉瘤进展[9]。然而，circRNA在肺腺癌的发展中的作用机制尚不明确。本研究通过高通量测序技术，筛选出在肺腺癌组织与癌旁组织中差异表达明显的hsa_circ_0016600, 探讨其在肺腺癌组织、细胞中的表达水平，及其在肺腺癌发生发展的新机制。

微小RNA(miRNAs)是一类内源性的小的非编码RNA，可诱导mRNA降解或抑制蛋白翻译[10]。研究发现，miRNAs参与细胞增殖、上皮-间质转化、转移等多种病理过程[11]。Hsa_circ_0110757可通过抑制miR-1298-5p上调ITGA1，从而促进胶质瘤的替莫唑胺耐药[12]。下调miR-1298亦可促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[13]。本研究将探讨miR-1298作为hsa_circ_0016600靶基因在肺腺癌进展中的分子机制。

TGFA及其受体表皮生长因子受体是重要的致癌基因[14]。有研究表明，在卵巢癌中TGFA可促进癌细胞增殖和迁移[15]。TGFA高表达可促进乳腺癌细胞的侵袭能力[16]。Hsa_circ_0016600作为miR-1298的海绵，可上调TGFA的表达，从而促进肺腺癌进展。本研究探讨Hsa_circ_0016600在肺腺癌中的表达水平与其对肺腺癌细胞增殖和迁移的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2019年10月至2020年12月江苏大学附属人民医院胸外科手术切除的40对肺腺癌标本，取距离肿瘤标本边缘≥3 cm的组织为癌旁组织标本，保存于含RNA固定剂的无酶EP管中，置于-80 ℃冰箱中备用。对5对临床肺腺癌组织与癌旁组织进行高通量测序。所有切除的组织都经术中或术后病理诊断为肺腺癌，且患者术前均未接受任何放、化疗治疗，不伴糖尿病、高血压等其他基础性疾病。本实验经过江苏大学附属人民医院伦理委员会批准(批准号：K-20180043-Y)，患者均签署知情同意书。

1.2实验试剂及主要细胞株高通量测序由上海欧易生物医学技术有限公司完成；胎牛血清、RPMI1640培养液及胰蛋白酶购于美国Gibico公司；小干扰RNA(siRNA)由上海吉玛制药技术有限公司设计合成；PCR引物由广州锐博生物技术有限公司设计合成；LipofectamineTM2000转染试剂、Trizol及Trizol LS试剂购于美国Thermo Fisher Scientific公司；Si-hsa_circ_0016600(Si-circ)用于敲减hsa_circ_0016600，Si-TGFA用于敲减TGFA，Si-NC作为对照组，购于广州瑞博生物技术有限公司；miR-1298-mimics(miR-mimics)用于过表达miR-1298，miR-1298-inhibitors(miR-inh)用于下调miR-1298，miR-NC作为对照组，购于广州瑞博生物技术有限公司；pcDNA3.1 TGFA(TGFA)用于过表达TGFA，pcDNA3.1为空质粒，购于南京秣氡基因技术有限公司。Transwell小室购于美国Corning公司；荧光定量试剂盒及逆转录试剂盒购于日本Takara公司；兔抗TGFA购于美国Affinity公司，兔抗β-Actin抗体及羊抗兔二抗购于武汉三鹰技术有限公司；A549、H1299和PC9人肺腺癌细胞株及BEAS-2B人永生化正常支气管粘膜上皮细胞株购于中国科学院上海生科院细胞中心。

1.3方法

1.3.1 组织测序对5对临床肺腺癌组织与癌旁组织进行高通量测序，由上海欧意生物医学科技有限公司完成。

1.3.2细胞培养细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，放置在37 ℃、5%CO2的细胞培养温箱中。经1到2 d培养后换液，当细胞贴壁生长达到80%～90%的时候进行细胞传代。把A549及PC9细胞株分别接种至2个6孔板中，当细胞融合度达到60%～70%后，将si-hsa_circ_0016600、miR-1298-inhibitors分别用LipofectamineTM2000按照说明书进行转染。

1.3.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)用Trizol法提取组织及细胞中的总RNA,用Trizol LS法提取血浆中的总RNA。用Takara逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA。利用美国Bio-Rad公司的CFX96实时荧光定量PCR仪对cDNA进行扩增以检测Hsa_circ_0016600在组合、细胞及血浆中的相对表达量。以GAPDH和U6为内参，GAPDH上游引物序列5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列为5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；U6上游引物序列5′-CTCGC TTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列5′-ACGCTTC ACGAATTTGCGTGTC-3′；Hsa_circ_0016600上游引物序列AGAGAAGAGCAGCCAGTTCCT，下游引物序列TCCTCCTTGTCCATCTCTTGA；miR-1298上游引物序列：5′-CGTTCATTCGGCTGTCCA-3,下游引物序列5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3;TGFA上游引物序列5′-AGCTGCTAGCGCCTAGCGAT-3′，下游引物序列5′-CCCGTCTGATAGCGCATTCGTGT-3′；Hsa_circ_0016600扩增体系为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。miR-1298扩增体系为：94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40个循环。用2-△△CT法计算Hsa_circ_0016600和miR-1298的相对表达量。每个实验独立重复3次，每个样品均设3个复孔。

1.3.4荧光素酶报告实验①将细胞(90% DMEM+10% FBS 培养)种植于 24 孔板中，大约10×103个/孔，每组设置 3 个复孔，放置于 5 % CO2、37 ℃的细胞培养箱中继续培养。②在24孔板中，用Lipofectamine 2000将miR-1298 mimics/NC和变异型Hsa_circ_0016600(Hsa_circ_0016600-MUT)/野生型Hsa_circ_0016600(Hsa_circ_0016600-WT)或变异型TGFA(TGFA-MUT)/野生型TGFA(TGFA-WT)转染到细胞中。③转染 24 h后，弃去培养液，向细胞中加入裂解液，吹打裂解细胞。④将测定底物加入 24 孔板。⑤从 24 孔板已破裂的细胞溶解液中吸取 10 μL加入荧光素酶测定底物中吹打均匀，在荧光检测仪下测定相关结果，并将数据记录下来。⑥每孔加入 100 μL终止液，混匀。在荧光检测仪下检测，记录数据。两次测出的数据比值表示样本的相对荧光强度。

1.3.5转染根据转染肺腺癌细胞不同分为：Si-NC组(Si-NC转染肺腺癌细胞)、Si-circ组(Si-hsa_circ_0016600转染肺腺癌细胞)、Si-TGFA组(Si-TGFA转染肺腺癌细胞)、miR-NC组(miR-1298-NC转染肺腺癌细胞)、miR-mimics 组(miR-1298-mimics转染肺腺癌细胞)、miR-inh组(miR-1298-inhibitors转染肺腺癌细胞)、Si-circ +miR-NC组(Si-circ、miR-NC转染肺腺癌细胞)、Si-circ +miR-inh组(Si-circ、miR-inh转染肺腺癌细胞)、si-NC+miR-NC组(si-NC、miR-NC转染肺腺癌细胞)、miR-NC+pcDNA3.1组(miR-1298-NC、pcDNA3.1转染肺腺癌细胞)、miR-mimics+TGFA组(miR-mimics、TGFA转染肺腺癌细胞)和miR-mimics+pcDNA3.1组(miR-mimics、pcDNA3.1转染肺腺癌细胞)。取无菌的1.5 mL EP管按照上述分组做好标记，先分别向每管中加入200 μL无血清RPMI-1640培养基和2 μL的lipofectamine 2000，再按照分组向其中加入2ug质粒或2 μL的小干扰RNA及相应对照组试剂，轻晃均匀后在超净台中室温静置20 min形成混合物。6孔板中每孔加入200 μL混合物，再加入不含血清及双抗的RPMI-1640细胞培养液中，使得6孔板每个孔的液体总体积在2000 μL左右，充分混合，在含有5% CO2，温度为37 ℃的细胞培养箱中孵育6～8 h后，取出6孔板，弃去原有培养液，再向每孔中加入不含有双抗的1640完全培养基，放入细胞培养箱继续培养24～48 h，取出后可用于后续实验。

1.3.6平板克隆形成实验将细胞PC9和A549分别接种于6孔板。置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中。每隔3～4天换液1次，10～14 d肉眼可见克隆团即终止培养。弃去培养液，PBS清洗3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛置于4 ℃冰箱固定30 min，再用PBS清洗3次，每孔加入1 mL 0.1%结晶紫染液，置于4 ℃冰箱30 min，双蒸水清洗至背景干净，对克隆形成数进行计，每组实验均重复3次。克隆形成率计算公式如下:

克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%

1.3.7侵袭实验在小室上层用预冷枪头加入25 μL已稀释的Matrigel胶(Matrigel胶∶预冷1640=1∶3)。将肺腺癌细胞PC9和A549消化后，重悬细胞于无血清培养基，上层中接种100 μL细胞悬液，在下层小室每孔加600 μL含有10%FBS的培养基，置于细胞培养箱中。孵育24 h后取出，弃去小室中的培养液，用棉签轻轻擦拭小室上层内侧未迁移的细胞，用PBS清洗3次，再用4%的多聚甲醛固定30 min,PBS再次清洗3次，0.1%的结晶紫染液染色30 min, PBS漂洗干净后倒扣晾干，显微镜下拍照，实验重复3次。

1.3.8蛋白免疫印迹法将肺腺癌细胞PC9和A549用RIPA裂解液冰上裂解提取蛋白。再以进行10%的SDS-PAGE凝胶电泳，恒压80 V，待蛋白至上下层胶交界处，加大电压为120 V，然后恒流350 mA、120 min进行转膜，再用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h, 4 ℃冰箱一抗(兔抗β-Actin 1∶500，兔抗TGFA 1∶1000)孵育过夜，TBST清洗3次，每次10 min，予以羊抗兔二抗(1∶5000)室温孵育2 h，再次TBST清洗3次，每次10 min，最后予以化学发光显影。使用Image J软件对条带进行半定量分析。

1.3.9细胞划痕实验将肺腺癌细胞PC9和A549分别接种于2个六孔板中，当六孔板中单层细胞生长达70%～80%时，用200 μL的无菌移液枪头垂直于六孔板底部划线，PBS冲洗3次，进行小干扰RNA转染，并更换为无血清的培养基，拍照记录为0 h，然后置于培养箱中继续培养至48 h后再次拍照记录宽度。

2 结 果

2.1 Hsa_circ_0016600的筛选高通量测序筛选出在肺腺癌组织中高表达的环状RNA hsa_circ_0016600。见图1。

图1 高通量测序结果

2.2Hsa_circ_0016600在肺腺癌组织及细胞系中的表达在肺腺癌组织中hsa_circ_0016600表达量明显高于癌旁组织[(3.24±1.22)vs(5.29±1.48)，P<0.05]；hsa_circ_0016600在3株肺腺癌细胞系PC9(17.53±0.97)、A549(3.33±0.52)、H1299(4.13±0.49)中的表达水平均明显高于正常支气管粘膜上皮细胞BEAS-2B(1.01±0.2)，差异有统计学意义(P<0.05)。在3种肺腺癌细胞株中，hsa_circ_0016600表达水平在A549细胞株中最低，而在PC9细胞株中表达水平最高，选择A549和PC9进行后续实验。

2.3Si-hsa_circ_0016600抑制 Hsa_circ_0016600肺腺癌细胞中的表达选取hsa_circ_0016600表达量最低的A549和最高的PC9转染小干扰RNA 24 h后，A549、PC9中Si-circ组hsa_circ_0016600的表达水平[(4.43±0.51)、(2.90±0.56)]明显低于Si-NC组[(8.30±0.52)、(10.73±0.64)]，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4敲减Hsa_circ_0016600对肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响克隆形成实验显示，A549和PC9中Si-circ组的克隆形成率[(2.07±0.40)、(2.90±0.40)]明显低于Si-NC组[(5.33±0.35)、(7.30±0.36)]，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验表明，A549和PC9细胞中Si-circ组的迁移率[(4.17±0.47)、(4.17±0.47)]较Si-NC组明显降低[(10.40±0.40)、(10.03±0.35)]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。Transwell侵袭实验显示，A549和PC9细胞中Si-circ组的侵袭细胞数[(5.37±0.55)、(8.87±0.78)]明显低于Si-NC组[(8.57±0.51)、(14.23±0.49)]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图2 敲减Hsa_circ_0016600抑制肺腺癌细胞的迁移

图3 敲减Hsa_circ_0016600抑制肺腺癌细胞的侵袭

2.5敲减TGFA 对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响将小干扰RNA转染入A549和PC9细胞中24 h后，蛋白免疫印迹实验显示Si-TGFA组TGFA表达量明显下降，见图4，表1。克隆形成实验显示，A549和PC9中Si-TGFA组的克隆形成率[(1.47±0.46)、(0.93±0.12)]明显低于Si-NC组[(7.20±0.72)、(4.27±0.23)]，差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭实验显示，A549和PC9细胞中Si-TGFA组的侵袭细胞数明显低于Si-NC组(P<0.05)，见图5，表1。细胞划痕实验表明，A549和PC9细胞中Si-TGFA组的迁移率较Si-NC组明显降低(P<0.05)，见图6，表1。

1：Si-TGFA组；2：Si-NC组

图5 敲减TGFA抑制肺腺癌细胞的侵袭

图6 敲减TGFA抑制肺腺癌细胞的迁移

表1 敲减TGFA后TGFA的表达及对肺腺癌细胞的迁移及侵袭

2.6Hsa_circ_0016600可能通过靶向miR-1298来调节TGFA表达Hsa_circ_0016600与TGFA的靶点预测如图7所示。荧光素酶报告基因实验显示，miR-mimics与hsa_circ_0016600-WT 或TGFA-WT 共转染时，荧光素酶活性显著下降，见表2、表3。实时荧光定量PCR表明，A549、PC9 Si-circ组miR-1298的表达水平[(7.03±0.31)、(5.40±0.66)]较Si-NC组[(3.07±0.31)、(2.50±0.44)]显著升高(P<0.05)。蛋白免疫印迹实验提示，转染miR-inhibitors后，与miR-NC组比较，miR-inhibitors组TGFA的表达水平显著升高(P<0.05)，而miR-mimics抑制了TGFA的表达(P<0.05)，见图8，表4。

表2 荧光素酶验证靶点验证Hsa_circ_0016600与miR-1298关系

表3 荧光素酶验证靶点验证TGFA与miR-1298关系

表4 转染miR-mimics及miR-inhibitors后TGFA的表达

图7 Hsa_circ_0016600与miR-1298、TGFA与miR-1298靶点预测

1:miR-mimics组; 2:miR-NC组; 3:miR-inhibitors组

2.7MiR-1298的下调影响hsa_circ_0016600的生物学功能与Si-circ+miR-NC组[(28.33±2.52)、(21.13±1.06)]比较，Si-circ+miR-inh组细胞克隆形成率在A549细胞及PC9细胞中[(44.43±2.17)、(43.67±2.8)]明显升高(P<0.01)；划痕实验显示，Si-circ+miR-inh组肺腺癌细胞A549及PC9的迁移率(53.73±1.07、48.63±1.18)较Si-circ+ miR-NC组(12.52±0.99、24.27±1.66)增高(P<0.01)，见图9；侵袭实验表明，Si-circ+miR-inh组肺腺癌细胞A549及PC9侵袭细胞数较Si-circ+ miR-NC组明显增多(P<0.05)，见图10，表5。

图9 miR-1298抑制剂对肺腺癌细胞的迁移能力影响

图10 miR-1298抑制剂对肺腺癌细胞的侵袭能力影响

表5 miR-1298抑制剂对肺腺癌细胞的侵袭能力影响

2.8TGFA的过表达抑制miR-1298对肺腺癌的作用与miR-mimics+pcDNA3.1组相比，miR-mimics+TGFA组的 A549细胞和PC9细胞中TGFA的表达明显上调(P<0.01)，见图11，表6。细胞克隆实验表明，与miR-mimics+pcDNA3.1组[(2.57±0.51)、(1.90±0.85)]相比较，miR-mimics+TGFA组肺腺癌细胞A549、PC9细胞的克隆形成率[(10.17±0.76)、(8.00±1.00)]增加(P<0.01)；划痕实验表明，与miR-mimics+pcDNA3.1组A549、PC9(10.87±1.56、12.42±0.63)相比，miR-mimics+TGFA组的细胞迁移率(34.97±1.86、48.38±2.84)增加(P<0.01)，见图12，表7；Transwell侵袭实验表明，miR-mimics+TGFA组的侵袭细胞数较miR-mimics+pcDNA3.1组增加(P<0.01)，见图13，表6。TGFA阻止了miR-1298过表达对肺腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的抑制作用。

1:miR-NC+pcDNA3.1组; 2:miR-mimics+pcDNA3.1组; 3:miR-mimics+TGFA组

表6 TGFA过表达质粒对转染miR-mimics的细胞中TGFA的表达及细胞侵袭能力的影响

图12 TGFA过表达质粒增强肺腺癌细胞迁移能力

图13 TGFA过表达质粒增强肺腺癌细胞侵袭能力

3 讨 论

肺腺癌是肺癌主要类型之一，早期症状不明显，不易诊断，且缺乏有效的治疗手段，发生率及死亡率均较高。因此急需进一步探讨肺腺癌的发生、发展机制。

circRNA不具备3′端加尾和5′端加帽结构，可抵抗外切核酸酶的降解作用，具有高度的保守性和稳定性[17]。因此，circRNA可被用来作为多种疾病的分子诊断标志物和治疗靶点。circRNA具有众多功能，最常见最早发现的就是发挥miRNA海绵的作用[18-19]，即环状RNA通过海绵miRNA对其产生负性调控作用[20]。例如，Wang等[21]发现circPVT1可以靶向结合miR-339-3p促进胆囊癌生长。敲减circ_0087378通过调节miR-40-3P/E2F3轴抑制食管鳞状癌细胞癌的发生发展[22]。本实验通过高通量测序在5对肺癌组织中筛选出了表达具有明显差异的环状RNA hsa_circ_0016600。本研究中，hsa_circ_0016600在肺腺癌患者组织细胞系中高表达，提示其可能在肺腺癌中促进癌症进展作用。细胞功能实验表明hsa_circ_0016600可促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

MiR-1298被报道在肝癌、胶质瘤、膀胱癌等多种癌症中均有表达，与肿瘤的发生发展及预后有密切联系[23-25]。结合荧光素酶报告基因实验的检测结果，从分子角度看，我们已经证实了hsa_circ_0016600与 miR-1298 之间存在结合位点。功能学实验也表明miR-1298抑制剂可部分逆转由于下调hsa_circ_0016600导致的对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭作用，即hsa_circ_0016600可通过miR-1298进而促进肺腺癌的发生和发展。

TGFA作为受体表皮生长因子受体的配体，可在多种癌组织和癌细胞中高表达，增强癌细胞的恶性行为。如TGFA表达上调可增强胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[26]。circRNA circANKS1B可通过海绵miR-152-3p上调TGFA从而促进前列腺癌的进展[23]。我们通过蛋白质印迹法，检测了TGFA在肺腺癌细胞中表达水平较高，敲减TGFA后，功能学实验表明肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力均减弱，hsa_circ_0016600和TGFA对肺腺癌细胞的生物学行为具有相同作用。荧光素酶基因结果证实了TGFA可为miR-1298的靶点，miR-1298 inhibitors组TGFA表达增加，miR-1298 mimic组TGFA表达减少，功能学实验表示TGFA的过表达可部分抑制miR-1298对肺腺癌细胞的作用。

综上所述，本研究表明，hsa_circ_0016600/miR-1298/TGFA在肺腺癌发生发展过程起到至关重要作用，可能成为肺癌诊断及治疗的新靶点。