循环肿瘤细胞在肺癌中的研究应用与未来展望

徐 静，高 雯

0 引 言

肺癌是全世界发病率和死亡率最高的肿瘤之一。随着精准医学的发展和靶向、免疫等药物研发取得的长足进步，肺癌治疗的有效率和生存期得到了极大的提升[1]。然而，早期诊断的延迟、肿瘤的异质性、耐药等难点仍然导致肺癌的致死率居高不下，这对更加精准的个性化标签的识别提出了更高要求。组织活检是病理诊断和分子诊断的金标准，然而对于较小的病变或位置较差的病变来说，仍具有挑战性。此外，对于肿瘤的时间和空间异质性来说，单一部位活检完全不能反映肿瘤全貌。对于精准化诊疗排头兵之一的肺癌来说，治疗过程中的多次活检尤为重要，然而组织学活检有创，反复多次及多部位活检是不现实的。基于上述，液体活检作为一种非侵入性的方法，不仅能解决反复取样的问题，同时也是极具潜力的时空异质性的解决策略，将从根本上促进癌症精准医学的发展。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)是液体活检中最重要的部分之一，是指从原发肿瘤或转移性肿瘤中排出后在外周血中循环的肿瘤细胞[2]。笔者所在团队曾梳理CTCs的生物学机制，认为其在肺癌领域具有很高的临床应用价值[3]。肿瘤细胞发生转移是多步骤复杂的过程，通常包括肿瘤细胞在原发部位的侵袭，之后通过血管内渗进入循环，极小部分循环中存活下来的肿瘤细胞突破血管屏障进入特定的组织部位附着和定植，最终通过增殖形成转移灶。循环肿瘤细胞CTC即为突破血管屏障并逃避了免疫系统后在血液循环系统中存活的肿瘤细胞，是代表肿瘤细胞转移的关键一步。CTC可以单个细胞存在，也可彼此间或者与血液来源的细胞聚集形成循环肿瘤微栓CTM，它们是形成肿瘤转移的“种子”，是我们了解肿瘤侵袭转移等生物学行为的关键“窗口”。见图1。CTCs可以单个细胞形式存在，也可以彼此聚集成簇，又称循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)。CTM被认为源于原始肿瘤细胞的寡克隆簇，是具备高度转移能力的“种子”[4-5]，这与我们传统认知的细胞数量级与转移的关联模型相一致[6]。随着CTCs在肺癌领域的研究不断丰富，CTCs的检出率和重复性被证实优于传统血清标记物，其起源于肿瘤的不同部位，有望更好地反映肿瘤的异质性[4-5]。CTCs的计数及其分子表型特征在肺癌的早期诊断、疗效预测、监测复发转移及分析耐药机制等方面，均可以提供有效信息。本文简要梳理CTCs的检测和富集技术，重点介绍CTCs在肺癌领域的应用和前景。

图1 CTCs和CTCs簇的产生和转移

1 浓缩、分离和检测CTCs的技术

CTCs由Thomas Ashworth在19世纪60年代首次发现的[7]。CTCs具有稀有性和异质性，因此，需要根据其生物学或物理学特性进行富集，然后进行基因表达或功能特点对富集到的细胞进行鉴定。目前CTC富集主要技术主要有：根据细胞表面标志物的免疫磁珠法，根据细胞密度的密度梯度离心法，CTC-chip微流控芯片技术，根据细胞大小的过滤法(isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)。其中免疫磁珠法是目前使用较为广泛的CTC分离方法，根据肿瘤的上皮抗原进行分离。上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)抗体检测CTCs的免疫阳性珠法最常使用,其局限性在于EpCAM在发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程中会出现下调，此外，EpCAM并不一定存在于所有类型的肿瘤中。一种可能的解决方案是阴性磁珠法，如EPISPOT技术利用免疫磁珠特异性结合白细胞共同抗原CD45，去除白细胞，把CTC富集出来，但是该方法无法区分CTM。除了直接检测方法外，基于mRNA的CTCs检测方法还使用转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)检测上皮或肺组织特异性mRNA来推断CTCs的存在。RT-PCR通过估计CTCs裂解物中特异性标志物的水平来间接检测CTCs，它假设检测到的mRNA转录本来自CTCs。然而，非特异性产物可以被扩增，这可能被误解为起源于肿瘤细胞，导致高估了CTCs的存在。基于上述生物特性分离方法均受肿瘤特异性抗原调节的限制，物理分离法仍旧被推崇，物理法得到的细胞群体更为全面，更有利于分析肿瘤异质性。ISET是根据细胞大小的物理特性来分离CTCs的代表性方法，且不依赖于细胞表面生物标志物，但存在细胞变形的问题。涡旋介导的可变形细胞术技术、微腔阵列系统以及基于电荷分离的介电阵列似乎可以克服细胞尺寸和形态差异的问题。流量控制芯片、微器件和微流控平台以其小型化、便携、高性价比、单细胞分析和在线分离/检测等优点，已成为未来CTCs新兴研究的主流技术。

2 CTCs在临床肺癌全程管理中的研究与应用

CTCs彼此之间在细胞大小和形态、分子表型、活性程度、转移潜能、增殖潜能等各方面可能都有所不同，是形成肿瘤转移的“种子”，是我们认识肿瘤恶性生物学行为的重要“窗口”。美国癌症联合委员会(AJCC肿瘤分期指南)提出，依据CTC的结果，在分期M0和M1之间加入cM0(i+)分期，从而使患者的诊治更加精准。目前CTC的研究布局覆盖了肺癌早期诊断、预后判断、复发转移监测、疗效预测和耐药机制分析等方面，见图2。

图2 CTCs的临床应用

CTC在肺癌领域最早涉足的领域是早期诊断和预后判断。2005年，研究人员首次在非小细胞肺癌患者的肺静脉中检测到CTCs。随后多项研究针对CTCs鉴别肺部良恶性病变进行了探讨，几乎都证实了CTCs在肺癌诊断中具有较高的敏感性和特异性，优于传统血清肿瘤标志物，是影像学成像的有效补充[8]。叶酸受体阳性CTCs(FR+-CTCs)的在肺癌中的诊断效能较高[9]，如与其他肿瘤标志物联合检测，可显著提高肺癌与肺部良性疾病的鉴别诊断效果。然而在高危人群的长期筛查中，CTCs是否具有前景尚需大样本前瞻性数据来证实。肺癌预后判断中，大量的研究证实CTC计数、分类和聚集与患者生存密切相关，如EMT型CTC、CTM等都被证实与远处转移和较差的预后相关，随着研究深入，CTC的基因表达谱和克隆分析也被证实与预后相关联[10-11]。

肺癌的治疗的难点在肿瘤内部和肿瘤之间的异质性，CTCs是极有潜力的解决策略之一。CTCs在治疗决策中开展的研究多为治疗前后CTC计数的变化，CTCs与患者疗效、耐药及复发转移的相关性。随着研究方法的不断丰富和对CTC内在机制的了解深入，将来研究的方向也会发生变革。

2.1CTCs与手术治疗在早期可手术的肺癌患者中，30%～50%的患者在手术后5年内会复发，即便是I期的患者五年生存率也只能维持70%～90%。液态活检在早期可手术患者的研究大多关注于实时监测复发转移和判断预后，但多中心前瞻性研究较少，暂不足以改变现有的诊疗实践。微小残留病灶MRD作为液态活检另一重要成员近年来在该领域崭露头角，亦值得关注。那么CTCs对于手术本身来说，有无指导作用？一些研究认为术中操作可能导致致瘤性CTCs的血液传播和形成循环中的肿瘤微栓子(CTM)[12-13]。为了减少手术引起的血源性CTCs的扩散，学者们比较了术中结扎顺序对播散的影响，术中结扎流出静脉可以减少肿瘤细胞的扩散，提高生存[13-14]。

2.2CTC与放疗肺癌患者接受病灶放疗后，CTC计数可以发生变化[15]，多项研究亦证明放疗前和放疗后较多的CTCs计数和靶病灶外复发密切相关[16]。有趣的是，有研究提出肺癌放疗可以动员活的CTCs进入血液循环，伴随DNA损伤相关分子的转录影响，有可能促进肿瘤转移，提出相关分子干预与放疗相结合的策略，以兼顾局部病灶控制和远处转移的预防干预[17]。

2.3CTCs与化疗早期研究即表明CTCs在化疗过程中的变化趋势与肿瘤治疗早期敏感再到晚期耐药的发展趋势相一致。另外，多数研究将基线CTCs计数的截点设定为5个，可以区分接受化疗的晚期肺癌患者的预后。一项CellSearch平台分析CTC与肺癌患者疗效和预后相关前瞻性研究证实，与CTCs≤5相比，CTC计数>5的患者的远期疗效和预后较差[18]。而另一方面，研究表明部分化疗药物可以通过影响CTC的EMT过程，反而促进肿瘤远期转移，提倡化疗决策中需考虑到相关影响因素。例如，倾向于使用吉西他滨，因为它可以通过减少EpCAM阳性的CTCs，进而通过HGF/cMET途径抑制EMT，从而对抗转移。

2.4CTCs与靶向治疗CTCs在肺癌靶向治疗中具有极大的应用优势。首先，肺癌靶向治疗中一旦出现获得性耐药，再次活检进行分子检测是指南推荐的，然而反复取材本身存在困难，肿瘤的空间异质性更是无法解决。目前认为CTCs水平的突变分析可能有助于发现异源突变，有助于克服异质性带来的干扰。结合新兴技术，如微流控数字聚合酶链式反应甚至可以灵敏地检测血浆中低丰度的EGFR突变，并进行准确的定量，帮助临床医师判读耐药机制。在一项国际多中心III期临床研究中，基于CTCs的T790M突变与组织活检的状态一致性高，可以用来评价一、二代EGFR-TKI治疗的耐药机制[19]。同样，CTCs对于肺癌其他靶点的耐药机制也能有效剖析，如，基于患者CTCs的ALK突变和接受ALK抑制剂后出现耐药的CTCs测序，可以指导ALK融合患者的靶向治疗[20]；又如，ROS1重排肺癌患者的CTCs显示ROS1基因异常的广泛异质性，伴随着高水平的染色体不稳定性，促进肿瘤转移[21]。另一方面，CTC计数及其分子特征在在预测患者靶向治疗疗效方面亦有临床意义。我国学者发现HK2标志物能够获得比传统基于EpCAM/CK方法更高的CTC检测灵敏度和更广泛的CTC谱，并且CK阴性的CTCs具有明显的癌细胞转移和EGFR抑制剂耐药性的分子特征[22]。研究表明EGFR突变的患者如存在伴随突变如EGFR/TP53共突变，往往预示靶向治疗疗效不佳，笔者团队前期将这类患者的CTCs进行分析，发现EGFR/TP53共突变的患者接受靶向治疗的疗效与CTCs计数密切相关，CTCs计数低的共突变患者依旧可以从靶向治疗中获益[23]。

2.5CTC与免疫治疗近年来，以程序性死亡分子(programmed death 1，PD-1)及其配体(programmed death-ligand 1，PD-L1)为代表的免疫检查点抑制剂ICIs重塑了肿瘤治疗模式，在多个肿瘤中带来了显著的临床获益和长生存。多项随机对照高级别临床研究证实，ICIs在肺癌的全线治疗中均可以带来临床和生存获益。然而，ICIs的总体有效率不高，对获批实体瘤有效率仅为20%～30%。目前用于预测肺癌免疫检查点抑制剂疗效的标志物主要为PD-L1表达，但即使高表达的肺癌，客观缓解率也仅为50%左右。PD-L1可同时表达于肿瘤细胞和免疫细胞，且存在瘤内和时空异质性，其检测受主观判读和不同平台缺乏标化的影响，临床继续更加完善的标记物系统。随着肿瘤及其微环境中的免疫细胞之间的相互作用成为关注的热点，CTCs与免疫攻击和逃役的之间的杀伐也被逐渐了解。现有研究认为CTCs可能利用MHC I进行伪装，逃脱免疫细胞的识别，也有可能通过FAS/FASL凋亡通路引发免疫逃逸，当然研究最多的就是CTCs用过表达免疫抑制蛋白而抑制免疫细胞的活性，比如PD-L1[24]。多项研究表明CTCs的PD-L1表达水平与肿瘤组织中PD-L1的表达水平相关，甚至有报道发现PD-L1在CTCs中的阳性表达率甚至高于肿瘤组织。CTCs PD-L1阳性与表达PD-L1阳性的CTC数目被认为与肺癌患者接受ICIs治疗的疗效相关。如基线期接受ICIs治疗前的CTC计数和出现PD-L1+CTCs与预后不良有关；治疗过程中跟踪CTCs，如CTCs的PD-L1表达持续增高或表达PD-L1阳性的CTCs计数增多提示对免疫治疗逐渐耐药[25]。进一步，科研人员引入“异倍体循环肿瘤内皮细胞CTEC”，研究发现CTC和CTEC在免疫治疗后会发生蛋白表型改变、细胞形态即染色体核转化，形成治疗耐药的亚型；耐药后的患者CTEC计数和PD-L1阳性CTEC数目增多，其中多倍体PD-L1阳性的CTEC具有内源性耐药的特性，在这当中含有8号染色体多倍体预示着明显缩短的PFS[26]。随着免疫治疗的开疆扩土，已有研究提示在溶瘤病毒、肿瘤疫苗、过继性免疫细胞治疗等领域，CTC亦有广阔的应用前景。

3 CTCs在肺癌领域的研究展望

液态活检极大地改变了传统的医学模式。作为液态活检重要成员的CTCs也成为我们探究肺癌恶性行为的重要研究素材，借助CTCs我们可以深入了解肿瘤EMT转化、循环肿瘤干细胞特征、循环肿瘤微栓形成和转移、CTC如何进行免疫逃逸以及耐药等分子机制，从而全方位助力肺癌的精准诊治。CTC除了具有规避肿瘤时空异质性的优势以外，还因具有完整的细胞形态，多组学特征保留完整，信息量也更为丰富。如与其他液态标记物互相补充，效能会更加显著。如，液态活检的另一主要成员ctDNA的主要缺陷在于缺乏细胞形态，当与CTC联合分析时，可以互作补充。然而，CTCs的研究和应用还面临许多挑战，如CTCs的异质性、脆弱性和对基因表达的不完全了解；如何进一步提高富集捕获的效率，提升以分子分型和功能的鉴定效能；如何建立永久性CTCs细胞系，用于抗转移药物的筛选和肺癌转移机制的分析；如何与单细胞技术深入结合进行研究；如何开发自动化、标准化甚至人工智能相结合的CTC多组学系统，进而进行大样本前瞻性研究以期高级别循证医学证据。肺癌作为精准化诊治的排头兵瘤种，对CTCs的临床应用要求更高。CTC未来必须和下游分析紧密结合，才会在肺癌领域大有作为。例如CTC与分子多组学相结合，利用高通量测序，针对单个CTC进行分析，但这又对捕获和富集技术提出更高的要求。相信未来，基于CTCs的机制和临床研究在肺癌精准化诊治领域会持续性发展，当更多的瓶颈被突破后，CTCs有望成为肺癌诊疗中不可或缺的一部分，助力肺癌精准化诊治全过程。