内蒙古汉族人群多发性硬化与HLA-DRB1基因型的相关性研究①

米飞跃 王蒂媛 殷旭华 郭 燕 韩建文（内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特 010050）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是中枢神经系统的一种自身免疫介导的炎性脱髓鞘疾病，目前多认为该疾病的发生是遗传和环境因素相互作用的结果，遗传易感基因受到越来越多学者的重视。其中人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）多态性是重要的遗传因素。HLA基因位于6号染色体短臂的6p21.3区，由一系列紧密连锁的基因座组成，在抗原呈递和免疫应答中起重要作用。诸多研究中发现不同人种、不同地区和不同种族与MS相关的HLA等位基因型并不完全相同，反映出某些遗传背景差异。其中HLA-DR15就明确增加了高加索人种MS的易感性［1-2］。目前，研究最多的是DQB1、DPB1、DRB1等Ⅱ类基因，它们主要集中在HLA的第二外显子，具有高度的多态性，且与MS的易感性密切相关。内蒙古汉族由于所处地理环境不同、饮食结构差别，以及不同种族之间结合所致的遗传背景差异，可能影响本地区汉族MS人群的遗传基因多态性，其中DQB1和DPB1等位基因已有本地区研究者做过检测，故此次仅针对性地采用高分辨分型的方法检测HLA-DRB1基因型，分析其与MS的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 观察对象40例内蒙古汉族MS患者，男12例、女28例，年龄21～57岁，平均（40.68±10.0）岁，所有患者均符合2010年的MacDonald临床诊断标准，且随访1.5年。40例内蒙古汉族健康对照者，男13例、女27例，年龄22～59岁，平均年龄（41.5±10.9）岁，已排除其他自身免疫病、神经系统等疾病。两组间年龄、性别差异无统计学意义。

1.1.2 试剂与仪器试剂盒：SeCore DRB1 Locus Sequencing Kit；5810R离 心 机（eppendorf公 司)；9700 PCR仪、3730XL测序仪（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取从全部入组对象中，抽取5 ml外周血，EDTA抗凝，-80℃保存，按说明书提取基因组DNA。

1.2.2 HLA-DRB1等位基因测序对HLA-DRB1基因进行高分辨率分型，采用美国Atria Genetics研发的基于测序的方法（SBT）。实验步骤：①样品准备；②PCR扩增；③扩增后产物处理；④测序反应；⑤乙醇沉淀；⑥毛细电泳检测；⑦分析；⑧确认结果。

1.2.3 数据分析运用测序分析软件处理收集的原始数据并创建测序文件。采用uTYPETMHLA测序分析软件，处理测序文件同时创建HLA分型报告。

1.3 统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计分析。基因频率用直接计数法，组间比较采用χ2检验；理论数＜5时，改Fisher精确概率法。用Bonferroni法（Pc）校正P值，将实验中检测到的基因数乘以P值，P＜0.05表示差异有统计学意义，相对危险度（RR）表示HLA基因对于MS的危险程度。

2 结果

在MS患者及对照组中，共检测到25个HLA等位基因片段，其中表1列出8个基因片段，其他所检测到的基因片段经检验差异均无统计学意义。MS组患者15：01等位基因频率（45.0%）高于ZC组（12.5%）（P=0.001，RR=1.591），经 校 正 后Pc为0.011，差异有统计学意义。MS组04：05等位基因频率高于对照组，11：01和12：02等位基因频率低于ZC组，但差异无统计学意义。

表1 MS组与ZC组等位基因型频率比较［例（%）］Tab.1 Comparison of allele frequency between MS group and ZC group［n（%）］

3 讨论

目前HLA基因占遗传风险因素的10%～40%，相比其他基因，被认为是与MS关联强度最大的遗传因素［3］。不同种族和地区中，与MS相关的HLA等位基因型也不完全相同，显示出遗传异质性。

大多数西方研究显示HLA-DRB1*15：01与MS发病显著相关，与正常人群相比，携带DRB1*15：01基因者罹患MS的风险增加3倍，使之成为MS最强的遗传危险因素［4-5］。在欧洲人群中DRB1*15：01等位基因频率为3%～20%，从南欧到北欧患者群随易感性的增加而增加［6］。传统型MS（C-MS）与DRB1*15：01相关联，这符合在白人中的研究结果［7］，而日本的一项研究发现视神经-脊髓型MS（OS-MS）患者中HLA-DPB1*0501基因呈高表达［8］。

在一项2008年对我国北方汉族人群的研究中表明，DR15可能是MS的易感基因［9］。西方人的MS以大脑、脑干病损为主（西方型MS），而我国和日本发现脊髓和视神经受损较为常见（亚洲型MS）。马建军等［10］对河南人群的研究认为亚洲型MS与DRB1*15：01无关，同时研究结果表明欧洲人类型的MS与DRB1*15：01相关。通过SBT，吴晓牧等［11］认为我国南方汉族人群C-MS可能与DRB1*12：02相关，OS-MS则与DRB1*04：06相关联，而我国北方汉族人群中部分OS-MS的易感基因可能是DRB1*12［12］。在这项研究中运用SBT法，对内蒙古汉族MS病例组和健康对照组进行HLA分型，这种分型方法的优点有：是目前分辨率最高的基因分型法，分型结果能精确到小数点后4位；弥补了先前PCR-序列特异性寡核苷酸探针、序列特异性引物等分型方法中结果的不确定，仅能对一种或者两种等位基因进行分型的缺点。本研究采取测序方法对实验对象所有DRB1等位基因进行分型分析，结果显示DRB1*15：01等位基因频率MS组（45.0%）显著高于健康对照组（12.5%），与大多数西方研究结论一致，提示DRB1*15：01可能是内蒙古汉族人群MS的易感基因，04：05等位基因频率高于正常对照组，但经检验差异无统计学意义，可能需要更大的样本证实。另外，本研究选取的患者均为确诊的MS，除外视神经脊髓炎患者，但结果却与西方型MS相似，而与其他地区的汉族人群的易感基因有差异，进一步提示了MS与HLA的相关性存在高度的异质性。

总之，根据国内的研究成果，尚不能得出一致的结论，归结原因可能有以下几点：遗传基础和地理环境不同；样本量多少、检验水准和分型方法的差异。