维生素D调节IFN-γ/IL-10分泌和抑制miR-326/miR-96表达改善EAE小鼠神经功能①

叶励超 黄玉婷（福建医科大学附属第二医院神经内科，泉州 362000）

实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是常用于研究人类多发性硬化（multiple sclerosis，MS）的动物模型，其特征为CD4+T细胞介导的、体液免疫及补体共同参与、针对髓鞘自身抗原的炎症反应，病理特征为中枢神经系统白质脱髓鞘、小血管周围炎症细胞浸润，以单核细胞为主［1］。

维生素D（Vitamin D，VD）参与人体钙、磷代谢和稳态维持，是自身无法合成的微量有机物质。人体通过暴露于阳光下、膳食摄入和服用药物等途径补充VD。近年VD被用于治疗多种免疫系统疾病，并取得了一定临床效果［2］。流行病学研究表明，MS发病率与日光照射时间显著相关［3］。早期生活时体内VD含量减少与MS患病风险可能存在某种关联。有研究报道，MS患者VD水平较正常人明显降低，提示人体VD缺乏或含量不足可能增加MS发病风险［4-6］。在动物模型中，补充VD可显著减轻EAE神经功能缺失症状，但VD发挥保护作用的病理生理机制尚不明确［7］。

microRNAs（miRNAs）在调节细胞增殖、分化、炎症反应、自身免疫性疾病和癌症中发挥重要作用。miR-326通过调控抗原特异性T细胞和B细胞调控免疫系统功能并影响自身免疫性疾病进展［8-9］。临床上MS患者在复发期和缓解期miR-326和miR-96均呈异常表达，说明miR-326和miR-96参与MS病理 形 成［10-11］。但VD是 否 通 过 调 节miR-326和miR-96进而影响MS进程尚未阐明。

因此，本研究通过建立EAE小鼠模型，评估VD对EAE小鼠细胞因子水平和miR-326和miR-96表达的影响，为MS的可能发病机制及防治提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验小鼠48只6周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠，体质量20～25 g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供。

1.1.2 主要试剂与仪器MOG35-55（上海翊圣生物）；完全弗氏佐剂、百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）、DEPC（美国Sigma）；VD、多聚甲醛（上海生工）；无VD纯化型饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司）；水合氯醛（上海Aladdin）；小鼠25-羟基维生素D3、小鼠IFN-γ、小鼠IL-10 ELISA试剂盒（北京丽科）；PCR引物、RT试剂、荧光定量PCR试剂、SYBR GreenⅠ（Western Biotechnology）；TRIzol（碧云天）；凝胶扫描系统（GDS8000，UVP，LLC）。

1.2 方法

1.2.1 EAE小鼠模型建立参考文献［12］，小鼠于22℃、55%湿度、12 h光/12 h暗循环饲养，自由饮食饮水。将MOG35-55采用PBS稀释至终浓度为0.5 mg/ml，与相同体积完全弗氏佐剂充分混合，制备0.25 mg/ml MOG35-55溶液，通过三通管将乳剂抽打为完全油包水状态。每只小鼠给予200µg MOG35-55处理。第1次免疫当日（第0天）和第2天（48 h）分别在小鼠背部中线两侧4个穴位皮下注射MOG35-55（每点0.2 ml或500 ng）。PTX按500 ng PTX/0.2 ml PBS比例配制成PBS缓冲液，腹腔注射500 ng（或0.2 ml）PTX，构建EAE模型。

1.2.2 VD干预和分组将小鼠随机分为VD干预组（VD组）和非VD干预组（NOVD组），每组24只。VD组小鼠喂食VD（200 U/d，5µg/d），隔天服用，连续30 d。在前期实验基础上，确定200 U/d为维持VD作用的最小剂量，VD组小鼠允许自由获得缺乏VD的食物。NOVD组小鼠30 d内仅食用无VD纯化型饲料。两种饮食均在EAE诱导前1 d（-1 d）给予，之前接受正常饲料。将VD组和NOVD组小鼠随机分为4个亚组：EAE诱导前组（-1 d）和EAE诱导后第10天组、第16天组、第30天组，每组6只。每天对小鼠进行监测，观察疼痛症状、行为，并记录食欲和活动水平。

1.2.3 神经功能评估采用Benson评分标准分别于EAE诱导后第10、16和30天评估小鼠神经功能。0分：无临床症状；1分：尾巴软绵绵或摇摇摆摆的步态；2分：摇摇摆摆伴尾软（共济失调）；2.5分：共济失调伴部分肢体瘫痪；3分：一侧肢体完全瘫痪；3.5分：一侧肢体完全瘫痪，另一侧肢体部分瘫痪；4分：四肢完全瘫痪；4.5分：垂死动物；5分：濒临死亡或死亡。

1.2.4 ELISA小鼠腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg），取眼球采血，静置2 h，4℃下3 000 r/min离心20 min，随后分离上层血清用于ELISA试验。每只小鼠取血清500µl，采用相应的ELISA试剂盒检测血清IFN-γ、IL-10和25-羟基维生素D3含量。

1.2.5 RT-qPCR检测采用放射免疫沉淀法从小鼠脊髓中提取总RNA，根据说明用cDNA合成试剂盒合成cDNA，SYBR GreenⅠPCR试剂盒检测miR-326和miR-96表达，引物序列见表1。以外部线虫miRNA（cell-miR-39）为内参。提取总RNA前将cell-miR-39以10 fmol/µl加 入 小 鼠 脊 髓 组 织 匀 浆中，PCR仪扩增，凝胶扫描系统处理，2-ΔΔCt法分析。

1.3 统计学处理采用SPSS21.0软件进行统计学分 析，数据以±s表 示，组间 比较采用ANOVA和Tukey检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VD减轻EAE小鼠神经损伤神经功能评估过程中，NOVD组与VD组神经功能评分总体趋势相似，分数先升高后降低。两组小鼠神经功能评分均在EAE诱导后第16天达到最高值，症状最为严重。免疫后10 d和16 d，VD组小鼠神经功能评分均明显低于NOVD组（P＜0.05）。免疫后30 d，NOVD组小鼠神经系统评分也高于VD组，但差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

图1 VD对EAE小鼠神经功能评分的影响Fig.1 Effects of VD on neurological scores of EAE mice

图2 VD对EAE小鼠25-羟基维生素D3含量的影响Fig.2 Effects of VD on secretion of 25-hydroxyvitamin D3 in EAE mice

2.2 VD增强EAE小鼠25-羟基维生素D3分泌在造模前1 d与造模后第10天，VD组与NOVD组小鼠血清25-羟基维生素D3水平差异无统计学意义（P＞0.05）。EAE诱导后第16天和第30天，NOVD组小鼠25-羟基维生素D3水平保持不变（P＞0.05），VD组显著升高（P＜0.000 1），且明显高于NOVD组（P＜0.000 1，图2）。

2.3 VD抑制EAE小鼠IFN-γ分泌、增加IL-10分泌EAE诱导前1天，VD组和NOVD组小鼠IFN-γ、IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05），EAE诱导后第10、16和30天，两组IFN-γ、IL-10水平均显著升高（P＜0.05），但VD组IFN-γ明显低于NOVD组（P＜0.000 1），IL-10水平明显高于NOVD组（P＜0.000 1），建模后第16天，IFN-γ达到最高水平，IL-10达到最低水平（图3）。

2.4 VD下 调EAE小 鼠miR-326和miR-96表 达VD组小鼠在EAE诱导后第10、16和30天，miR-326表达差异无统计学意义（P＞0.05），但与NOVD组相比显著降低（P＜0.01，图4A）。NOVD组小鼠EAE诱导后第10、16和30天，miR-96表达差异无统计学意义（P＞0.05），但VD组较NOVD组显著降低（P＜0.001，图4B）。

图3 VD对EAE小鼠IFN-γ和IL-10含量的影响Fig.3 Effects of VD on secretion of IFN-γand IL-10 in EAE mice

图4 VD对EAE小鼠miR-326和miR-96表达的影响Fig.4 Effects of VD on expressions of miR-326 and miR-96 in EAE mice

3 讨论

MS是一种慢性自身免疫紊乱性疾病，主要损伤中枢神经系统的大脑白质和脊髓，具有多病灶、易复发等特点。疾病常导致患者遗留感觉、运动等神经系统功能障碍，严重威胁个人、家庭和社会健康。EAE动物模型的临床特点、免疫应答和病理变化与人类MS高度一致，因此常用于MS研究，但MS发病的具体机制尚未阐明。目前多数学者认为，MS和EAE的免疫学机制均为T细胞和B细胞靶向髓鞘特异抗原导致的炎症性脱髓鞘反应。

研究报道，增加阳光照射和VD摄入可提高人体活性VD浓度，日照时间少、VD含量低可能是MS的重要危险因素［3-5］。补充VD能部分减轻MS患者炎症脱髓鞘［13］。多项实验也证实VD治疗具有保护EAE、减轻神经系统损伤作用，其可能机制如下：mTOR是一个重要的真核细胞信号，可影响细胞因子表达，VD通过抑制多效性细胞mTOR通路参与免疫抑制［14-15］；自噬在保护神经元功能中扮演关键角色，VD具有调节自噬、减轻神经元损伤作用［16］；通过诱导Nrf2/血红素加氧酶1/一氧化碳轴预防EAE［17］。本研究显示，VD治疗组EAE小鼠神经功能评分显著降低，表明VD可能减轻EAE炎症性脱髓鞘损伤，发挥神经保护作用。EAE诱导后的第16天和第30天，小鼠血清25-羟基维生素D3水平显著升高，提示作为VD的一种活性形式，25-羟基维生素D3参与EAE炎症过程，能够有效减轻临床症状，与既往研究结论一致［18］。表明补充VD治疗对EAE小鼠有保护作用，可能间接激活25-羟基维生素D3产生。但有学者认为25-羟基维生素D3在EAE自身免疫应答中不起关键作用，因为缺乏VD受体的EAE小鼠也部分受到VD保护［19］。本研究在EAE诱导后第10天，VD组和NOVD组血清25-羟基维生素D3水平差异无统计学意义，推测体内25-羟基维生素D3分泌存在复杂的调节机制，有待深入研究。

CD4+T细胞可介导MS炎症脱髓鞘过程，辅助性T（Th）细胞进一步分化为不同亚群，包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞，通过分泌细胞因子和趋化因子协调不同免疫效应。由Th1细胞分泌的炎症因子，如IFN-γ、TNF、IL-12等深入参与MS发生和进展，Th2细胞分泌的炎症因子，如IL-10，TGF-β等可以有效减轻MS炎症和缓解疾病；Th17细胞分泌IL-17、IL-6和TNF-α等细胞因子，促发MS患者中枢神经系统炎症和组织损伤［20］。细胞因子IFN-γ参与自身免疫病理生理过程，是导致MS和EAE发病的主要炎症递质，IFN-γ水平升高可诱发和加重疾病。EAE小鼠在禁食后IFN-γ分泌减少，神经损伤严重程度明显降低［21］。本研究VD组小鼠IFN-γ水平明显低于NOVD组，提示VD可抑制IFN-γ分泌，从而间接缓解EAE症状。细胞因子IL-10能减轻EAE炎症反应。近年研究发现，骨髓间充质干细胞可促进小胶质细胞表型极化，由M1型转变为M2型，从而改善EAE相关神经功能，其特征为IL-10表达增加［22］。本研究显示，VD在EAE诱导后第10、16和30天促进IL-10分泌，减轻EAE小鼠神经损伤。但在EAE造模后第16天，IL-10水平未见显著差异（VD组仅轻微升高），可能与EAE小鼠该天神经功能评分达到峰值、症状最严重有关。

miRNA参与机体炎症反应与免疫系统功能调节，通过影响T细胞和B细胞功能调控自身免疫性疾病进展。miR-326是Th17细胞相关miRNA，在MS复发和缓解期显著过表达［10］；miR-96可增强Th17细胞致病性，复发缓解型MS患者血浆miR-96表达增强［23］。VD干预是否会影响EAE小鼠模型miR-326和miR-96表达尚不清楚。本研究测定了这两种miRNAs表达，结果发现VD干预的EAE小鼠miR-326和miR-96表达明显减少，提示VD可能通过抑制miR-326和miR-96表达从而调节自身免疫与炎症反应，改善EAE小鼠神经功能。此前一项研究表明，VD受体被预测为miR-326的直接靶点，相关机制有待进一步研究［24］。

总之，本研究证实VD能促进小鼠体内25-羟基维生素D3形成，VD可能通过减少IFN-γ生成、促进IL-10分泌、下调miR-326和miR-96表达改善EAE小鼠神经功能。实验结果支持VD对EAE小鼠发挥保护作用的事实，从而为EAE提供了一种潜在治疗方法。本研究存在一定局限性，如各组实验动物数量较少；未进一步阐明miR-326和miR-96对T细胞和Th17细胞反应的影响，如Th17/Treg平衡，需要更多实验探究miR-326和miR-96在EAE中的作用，未研究VD对VD受体表达的调控作用。