基于Nrf2/HO-1信号通路探讨lncRNA H19对支原体感染肺炎小鼠肺组织的影响

张 晓 李伟华（山东第一医科大学第三附属医院急诊科，济南 250031）

肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）是由肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）引起的呼吸道感染性肺炎，通常表现为间质性肺炎，其发病机制复杂，与感染引起的上皮细胞凋亡和机体的过度免疫应答有关，主要包括免疫细胞激活和细胞炎症因子分泌［1-2］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类核苷酸长度大于200 nt、无编码蛋白质功能的RNA，可参与细胞增殖、分化和凋亡等过程，还能够调节信号通路参与炎症性疾病的发生、发展［3］。研究表明lncRNA H19与人类多种肺部疾病的发生、发展密切相关，如ZHONG等［4］发现敲除lncRNA H19后，肺癌细胞增殖减少，细胞周期停滞在G1期，细胞凋亡水平提高，迁移和侵袭减少。LIU等［5］表明过表达lncRNA H19可诱导非小细胞肺癌细胞A549发生上皮-间质化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并促进细胞增殖及侵袭。WAN等［6］发现H19 mRNA在特发性肺纤维化患者及博莱霉素诱导的小鼠肺组织中上调，lncRNA H19缺乏可改善博莱霉素诱导的肺部炎症和纤维化。感染性肺炎患者体内免疫功能损伤，炎症反应激烈。核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）能够调节多种抗炎和抗氧化基因的表达，在机体损伤应答中居核心地位，而血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是Nrf2发挥作用的重要媒介。Nrf2/HO-1信号通路参与多种组织器官的炎症相关病理过程。如SHEN等［7］发现脂肪干细胞外泌体可以通过调节Nrf2/HO-1的表达将巨噬细胞极化为抗炎表型，并改善脓毒症中的炎症反应和损伤。KHADRAWY等［8］发现在四氯化碳诱导的肝纤维化模型中，骨髓间充质干细胞通过激活Nrf2/HO-1信号抑制氧化应激、炎症和肝纤维化。ARKALI等［9］发现香芹酚对雄性大鼠糖尿病诱导的生殖损伤具有保护作用，通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制NF-κB介导的睾丸细胞凋亡和炎症。而Nrf2/HO-1信号通路在支原体感染的肺炎中鲜有报道。

因此，本研究通过构建支原体感染肺炎小鼠模型及肺泡上皮细胞A549模型，探究lncRNA H19通过调控Nrf2/HO-1信号通路对小鼠肺组织的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级4周龄BALB/c小鼠60只，雌雄各半，体质量18～22 g，购自豪威生物科技有限公司［SYXK（津）2019-0006］。饲养环境为室温23～25℃、标准湿度55%～60%、12 h/12 h昼夜交替、饮水饮食正常、分笼饲养，并于1周后实验。本研究经山东第一医科大学第三附属医院伦理委员会批准（20190523）。

1.1.2 主要试剂和仪器肺炎支原体国际标准菌株ATCC FH15531购自美国菌种保藏中心；肺泡上皮细胞A549购自上海生工生物公司；RPMI1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购自上海碧云天生物技术有限公司；B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京博尔西科技有限公司；CyclinD1、Nrf2、HO-1抗体购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒购自武汉博士德生物有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Thermo酶标仪购自上海热电仪器有限公司；冷冻离心机购自美国Beckman公司；组织包埋机购自德国Leica公司；蛋白电泳、仪转膜仪购自美国伯乐公司；电子显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作与分组利用10倍稀释法将待测菌液用培养基稀释成1×10-12～1×10-1CCU/ml一系列浓度，于37℃恒温培养，以培养基由红色变为黄色时的最高稀释度为待测菌液的CCU，菌液浓度以1×107CCU/ml。

将60只小鼠采用随机数字表法分为4组：对照组（control组）、模型组（MP组）、转染siRNA阴性对照组（si-NC组）和转染lncRNA H19 siRNA组（si-H19组）。各组小鼠均腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，si-NC组鼻腔滴入阴性对照siRNA，si-H19组滴入lncRNA H19 siRNA，对照组和模型组滴入等量生理盐水。24 h后，除对照组外，其余组用1 ml注射器缓慢向鼻腔中滴入0.1 ml 1×107CCU/ml的MP菌液，对照组滴入等量培养基，1次/d，连续滴鼻3 d造模。造模结束后，颈椎脱臼处死小鼠，打开胸腔，剥离肺组织样本，观察病变程度；部分置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫组化；部分置于-80℃冻存，用于ELISA、qRTPCR和Western blot检测。

1.2.2 细胞模型制作与分组A549细胞接种于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。将A549细胞分为对照组（control组）、模型组（MP组）、转染siRNA阴性对照组（si-NC组）、转染lncRNA H19 siRNA组（si-H19组）、转染pcDNA3.1空质粒组（pcDNA-NC组）和转染pcDNA3.1-lncRNA H19质粒组（pcDNA-H19组）。各组分别转染对应的RNA及质粒。24 h后，流式细胞仪检测转染效率。除对照组外，其余组使用1×107CCU/ml的MP菌液感染A549细胞，4 h后，洗去未黏附的MP，并用RPMI1640培养基继续培养。

1.2.3 HE染色观察小鼠肺组织病理学改变取出4%多聚甲醛固定的肺组织，将样品包埋石蜡制成3µm厚的切片，后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木精-伊红染色、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性胶封固等，最后于显微镜（×200）下观察肺组织结构。

1.2.4 qRT-PCR检测肺组织和细胞中lncRNA H19 mRNA的表达采用Trizol试剂从肺组织和细胞中提取总RNA。使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，并使用SYBR Green法进行扩增，GAPDH作为内参。反应条件：95℃预变性5 min，95℃45 s，60℃30 s，共40个循环。使用2-ΔΔCt公式计算lncRNA H19的相对表达水平。lncRNA H19正向引物序列：5"-TGAAGGAACAGACGGTGACAACATC-3"，反向引物序列：5"-TAGAGGCTTGGCTCCAGGATGATG-3"。GAPDH正向引物序列：5"-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3"，反向引物序列：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。

1.2.5 ELISA检测肺组织和细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量取出小鼠冻存的肺组织和A549细胞，低温超声匀浆裂解，收集组织和细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明，稀释标准品，绘制标准曲线，检测小鼠组织和细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.2.6 免疫组化染色观察小鼠肺组织Bcl-2、Bax、MMP-9的表达将切片于60℃烤箱熔蜡，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，进行高压抗原修复，3%H2O2室温浸泡，PBS洗涤3次，分别滴加兔抗大鼠一抗Bcl-2、Bax、MMP-9（1∶100）4℃孵育过夜，PBS洗涤，次日滴加山羊抗兔二抗孵育20 min，快速滴加DAB显色液显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水、透明、封片，显微镜（×200）下观察，使用ImageProPlus 6.0软件分析阳性染色区域的平均光密度值（equally optical density，EOD）。

1.2.7 细胞单克隆形成及MTT法检测细胞增殖能力单克隆形成实验：调整细胞密度为1×103个/孔接种于6孔板培养，每组设3个复孔。培养10 d后，用4%多聚甲醛溶液固定，用结晶紫染色，倒置显微镜（×40）观察菌落形成情况并拍照。MTT实验：调整细胞密度为1×103个/孔并接种于96孔板培养，每组设3个复孔，分别培养24 h、48 h、72 h、96 h，加入MTT溶液，37℃孵育4 h，离心去上清，加入DMSO，使用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度值。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI染色检测各组细胞凋亡能力调整细胞密度为1×103个/孔并接种于6孔板，每组设3个复孔，细胞培养48 h后进行胰酶消化，离心后收集细胞，加入500µl Binding Buffer悬浮细胞，再各加入5µl Annexin V-FITC及PI混匀，室温避光孵育15 min后用流式细胞仪检测。

1.2.9 Western blot检测肺组织和细胞中Nrf2、HO-1、CyclinD1蛋白表达取冻存的肺组织和A549细胞，低温超声匀浆裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取等质量蛋白上样、电泳、转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Nrf2、HO-1、CyclinD1一抗（1∶2 000）4℃过夜，TBST漂 洗3次，加入 二抗（1∶10 000）室温孵育2 h，TBST漂洗3次，用ECL发光剂显影，Quantity One软件进行各组蛋白灰度分析，GAPDH为内参校正。

1.3 统计学分析数据分析应用软件SPSS16.0，作图软件采用GraphPad Prism 5.0，计量资料以±s表示，采用独立t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA H19对支原体感染肺炎小鼠肺组织的影响HE染色观察小鼠肺组织形态，结果显示：对照组双肺呈粉红色，肺泡壁光滑有弹性，无充血，镜下肺泡结构完整，肺泡腔大小一致，肺泡壁薄，无间隔水肿及炎症细胞浸润；MP组、si-NC组双肺塌陷，表面粗糙，呈灰白色，均匀分布点状淤血斑点，镜下肺泡大量塌陷，肺泡间隔增厚，出现不同程度增生，甚至融合为大肺泡，肺泡内有充血及炎症细胞浸润；si-H19组情况较MP组肺部形态有所改善，双肺较红润，存在肺泡结构，但局部可见少量肺塌陷及肺泡间隔增厚，少量肺泡融合，见图1A。说明敲减lncRNA H19会改善肺部病理形态。qRT-PCR检测lncRNA H19 mRNA在肺组织中的表达，结果显示，与对照组相比，MP组、si-NC组lncRNA H19 mRNA水平升高（P＜0.05）；与si-NC组相比，si-H19组lncRNA H19 mRNA水平降低（P＜0.05），见图1B。说明lncRNA H19在肺炎组织中表达升高。ELISA检测肺组织炎症因子的表达，结果显示：与对照组相比，MP组、si-NC组TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05）；与si-NC组相比，si-H19组TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05），见图1C。说明敲降lncRNA H19能够降低小鼠肺组织炎症因子水平。免疫组化和Western blot检测了增殖、凋亡及Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白的表达，结果显示：与对照组相比，MP组、si-NC组CyclinD1、Bcl-2蛋白水 平 降低，Bax、MMP-9、Nrf2、HO-1蛋 白水 平升 高（P＜0.05）；与si-NC组相比，si-H19组CyclinD1、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白水平升高，Bax、MMP-9蛋白水平降低（P＜0.05），见图1D、E。说明敲降lncRNA H19可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路促进细胞增殖并抑制其凋亡。综上，敲降lncRNA H19水平对支原体感染肺炎小鼠肺组织具有保护作用。

图1 lncRNA H19对支原体感染肺炎小鼠肺组织的影响Fig.1 Effect of lncRNA H19 on lung tissue of mice with mycoplasma infection with pneumonia

2.2 lncRNA H19对支原体感染A549细胞的影响qRT-PCR检测lncRNA H19 mRNA在A549细胞中的表达，结果显示：与对照组相比，MP组lncRNA H19 mRNA水平升高（P＜0.05）；与si-NC组相比，si-H19组lncRNA H19 mRNA水平降低（P＜0.05）；与pcDNA-NC组 相 比，pcDNA-H19组lncRNA H19 mRNA水平升高（P＜0.05），见图2A。说明支原体感染后lncRNA H19表达升高。ELISA检测A549细胞炎症因子的表达，结果显示：与对照组相比，MP组TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05）；与si-NC组相比，si-H19组TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）；与pcDNA-NC组相比，pcDNA-H19组TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05），见图2B。说明敲降lncRNA H19水平能够降低A549细胞炎症因子水平，而过表达lncRNA H19提高炎症因子水平。单克隆形成、MTT法、Annexin V-FITC/PI染色及Western blot对细胞的增殖、凋亡情况和Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白的表达进行了检测，结果显示：与对照组相比，MP组单克隆数减少，24 h、48 h、72 h、96 h OD值降低，细胞凋亡率升高，CyclinD1水平降低，Nrf2、HO-1水平升高（P＜0.05）；与si-NC组相比，si-H19组单克隆数增多，24 h、48 h、72 h、96 h OD值升高，细胞凋亡率降低，Nrf2、HO-1、CyclinD1水平升高（P＜0.05）；与pcDNA-NC组相比，pcDNA-H19组单克隆数减少，24 h、48 h、72 h、96 h OD值降低，细胞凋亡率升高，CyclinD1、Nrf2、HO-1水平降低（P＜0.05），见图2C～F。说明敲降lncRNA H19可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路促进细胞增殖并抑制其凋亡。综上，敲降lncRNA H19水平对A549细胞具有保护作用，而过表达lncRNA H19损伤A549细胞。与支原体感染肺组织结果一致。

图2 lncRNA H19对支原体感染A549细胞的影响Fig.2 Effect of lncRNA H19 on mycoplasma infection of A549 cells

图3 lncRNA H19基于Nrf2/HO-1信号通路调控支原体感染肺炎的作用机制Fig.3 Mechanism of lncRNA H19 in regulating mycoplasma infection pneumonia based on Nrf2/HO-1 signaling pathway

2.3 lncRNA H19调控支原体感染肺炎的作用机制构建支原体感染肺炎小鼠模型及A549细胞模型，发现lncRNA H19在支原体感染的肺组织和细胞中表达上调。敲减lncRNA H19后，促进了细胞增殖，并抑制了细胞凋亡及炎症水平，同时Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达增加；而过表达lncRNA H19能挽救上述影响。由此推断敲减lncRNA H19能够减轻小鼠肺部炎症反应，促进细胞增殖并抑制其凋亡，其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路有关（图3）。

3 讨论

肺炎支原体感染引起的MPP占社区获得性肺炎的40%，容易在儿童中暴发流行，能够造成患者肺部严重损伤，甚至威胁生命［10］。lncRNA H19位于人11号染色体和小鼠7号染色体上，是肺损伤和炎症的重要调节因子。如刘江华等［11］发现lncRNA H19在脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中高表达。赵炎等［12］发现敲减lncRNA H19能够提高肺炎链球菌诱导的A549细胞活性，抑制炎症因子的表达，抑制细胞凋亡。ZHANG等［13］发现支气管肺发育不良小鼠模型H19上调，肺部出现充血及炎症细胞浸润，下调lncRNA H19通过下调STAT3引起的炎症反应，从而减轻肺损伤。本研究肺炎支原体感染的肺炎小鼠模型和A549细胞模型中，lncRNA H19也呈现高表达，且肺部病理学显示，肺炎模型组双肺塌陷呈灰白色，肺泡间隔增厚，内有充血及炎症细胞浸润；而敲减lncRNA H19后，肺部形态及结构明显改善，局部仅见少量肺塌陷及肺泡间隔增厚。说明lncRNA H19可能参与了支原体感染肺炎的发生、发展。

MP感染导致机体免疫紊乱，产生炎症浸润，释放TNF-α、IL-6和IL-1等细胞炎症因子。TNF-α是早期细胞炎症因子，介导中性粒细胞的释放，诱导局部炎症反应。IL-6是炎症反应的重要介质，参与整个炎症反应，在机体免疫调节中起重要作用。MMP-9是金属蛋白酶类家族成员，由巨噬细胞、中性粒细胞、毛细血管内皮细胞等分泌，在炎症反应中发挥重要作用。动物实验表明，Nrf2/HO-1级联反应对肺组织中的氧化应激、炎症反应、细胞凋亡均具有显著的抑制作用［14］。如张洁等［15］发现，MP感染后血清TNF-α和IL-6水平与感染程度呈正相关，其水平可准确反映患者病情。李娜等［16］研究结果表明，祛湿通络方通过下调MP感染的RAW264.7细胞的TNF-α、IL-6的高表达，减轻炎症反应。曹波等［17］发现VD3通过下调NF-κB及MMP-9表达，降低肺炎支原体感染小鼠肺内的炎症反应。AMATA等［18］研究发现，Nrf2/HO-1在氧化应激诱导的早产儿肺损伤反应中被激活，从而诱导一系列抗炎信号的表达。本研究结果表明，与对照组相比，MP组小鼠肺组织出现大量炎症细胞浸润，肺组织和A549细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、MMP-9、Nrf2和HO-1水平升高；敲减lncRNA H19后各炎症因子水平降低，Nrf2和HO-1水平升高；过表达lncRNA H19后各炎症因子水平升高，Nrf2和HO-1水平降低。说明MP感染激活机体免疫应答，促发炎症反应，而敲减lncRNA H19通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制炎症产生。

MP感染细胞后，可直接诱导细胞凋亡。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2家族成员，二者协同调控机体细胞凋亡。CyclinD1是促增殖基因，参与细胞周期的调控，能够促进细胞周期发展，增强细胞活力。李向峰等［19］研究结果表明，鱼腥草总黄酮通过升高肺炎支原体感染小鼠肺组织Bcl-2蛋白和mRNA水平，降低Bax蛋白和mRNA水平，抑制细胞凋亡。杨志敏等［20］发现芩百清肺浓缩丸能促进肺炎支原体感染的A549细胞增殖并抑制细胞凋亡。吴振起等［21］发现清燥救肺汤以Bax、Bcl-2为效应靶点，抑制Caspase-3的表达，使细胞可以免于凋亡。孙小单等［22］表明阿帕替尼通过下调NRF2/HO-1通路，抑制卵巢癌CAOV-3细胞内Bcl-2水平，提高Bax水平，发挥抑制增殖和诱导凋亡的作用。本研究中与对照组相比，MP组小鼠肺组织Bcl-2、CyclinD1表达降低，Bax表达升高；敲减lncRNA H19后Bcl-2、CyclinD1表达升高，Bax表达降低；过表达lncRNA H19后Bcl-2、CyclinD1表达降低，Bax表达升高。同时支原体感染A549细胞体外实验也表明敲减lncRNA H19能促进MP感染细胞的增殖，抑制细胞凋亡。

综上所述，lncRNA H19在支原体感染肺炎小鼠肺组织中表达上调，敲降lncRNA H19能够减轻小鼠肺部炎症反应，促进细胞增殖并抑制其凋亡，其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。