Clara细胞10 kD蛋白通过调控T细胞反应治疗小鼠变应性鼻炎研究①

余海静 汪 琳 王志斌 刘 阳

（华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉-头颈外科，武汉 430030）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是最常见的、由环境变应原（主要包括草花粉和尘螨）诱导的IgE介导的Ⅰ型变态反应，影响全球10.5%～25%人口［1］。尽管患者可接受口服抗组胺药、鼻内类固醇皮质激素和过敏原免疫治疗，但效果欠佳［2］。因此，迫切需要寻找更有效的治疗方法。

调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）在炎症性疾病中控制免疫平衡［3］。Tregs通过分泌抑制性细胞因子（如IL-10和TGF-β1）发挥作用［4］。此外，Tregs通过细胞毒性T淋巴细胞抗原-4和组胺受体2等膜结合分子发挥生物学功能［5］。Tregs功能失衡参与类风湿关节炎、自身免疫性肝炎、癌症、气道疾病等发病过程［6］。Tregs对疾病免疫应答的调节作用已被广泛研究，因此寻求增强T调节反应的治疗方法越来越受到重视［7］。

Clara细胞10 kD蛋白（CC10）是分泌珠蛋白家族成员，课题组前期结果表明其具有免疫调节作用［8］。此外，课题组最近数据还表明CC10可抑制AR模型局部Th17反应［9］。但其对T调节细胞应答的调节作用尚未研究。因此，本研究拟探讨CC10对AR小鼠T细胞反应及T调节细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物8周龄C57BL/6J小鼠取自华中科技大学同济医学院实验动物中心，置于SPF级环境饲养。

1.1.2 主要试剂OVA（Ⅴ级，Sigma）；ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 AR小鼠建模及CC10给药参考课题组前期方法建立AR小鼠模型［10］，将小鼠分为4组：对照组（Control）、AR组、AR+CC10组和AR+PBS组，每组5只。AR组小鼠第0、7天皮下注射10µg OVA和1.6 mg氢氧化铝，第14～18天每天用10µg OVA加至40µl PBS进行鼻内激发（20µl/鼻孔）。对照组用PBS致敏，OVA激发。最后1次激发24 h后处死小鼠。AR+CC10组小鼠每次OVA激发前2 h在40µl PBS中加入1.4µg CC10进行鼻腔滴入（20µl/鼻孔）。AR+PBS组小鼠仅给予等量PBS。

1.2.2 小鼠搔鼻次数计数统计最后1次经鼻PBS或OVA激发24 h后，两名观察者记录10 min内搔鼻次数。

1.2.3 鼻腔灌洗液（nasal lavage fluid，NLF）获取按课题组前期方法收集NLF［10］。离心NLF，取上清，-80℃保存，ELISA测定细胞因子水平。NLF细胞沉淀物稀释于1 ml PBS用于HE染色。

1.2.4 ELISA检测NLF中IFN-γ、TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-5水平按照ELISA试剂盒说明检测IFN-γ、TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-5水平，IFN-γ检测灵敏度为5 pg/ml，TGF-β1和IL-5检 测灵敏 度 为2 pg/ml，IL-10和IL-17检测灵敏度为1 pg/ml。

1.2.5 组织病理学按课题组前期方法制备鼻腔黏膜载玻片［9］。对杯状细胞进行Schiff染色。在4个随机选择的区域中对上皮杯状细胞进行计数，杯状细胞以上皮包含个数/mm表示。将稀释后的NLF细胞置于载玻片上风干，用于HE染色。随机选取4个视野进行嗜酸性粒细胞计数分析。NLF嗜酸性粒细胞表达为：个/ml。

1.2.6 定量PCR参照课题组前期方法进行定量PCR［9］。PCR法检测基因mRNA表达。引物序列：FOXP3正向引物5′-GCCAAGCAGAAAGATGACAG-3′，反向引物5′-TTCCAGATGTTGTGGGTGAG-3′；β-actin正向引物5′-GCAGAAGGAGATTACTGCTCT-3′；反向引物5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。

1.3 统计学分析采用SPSS23.0软件分析数据，结果以±s表示。采用单因素方差检验比较不同组结果，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CC10改善AR小鼠鼻部搔鼻症状AR小鼠经鼻OVA激发后出现搔鼻症状，搔鼻次数显著多于对照组（P＜0.01）。CC10治疗明显减轻了AR小鼠搔鼻症状，与PBS处理组相比差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

2.2 CC10降低AR小鼠NLF中嗜酸性粒细胞及上皮杯状细胞数细胞滴片HE染色结果显示，AR组小鼠嗜酸性粒细胞明显多于对照组（P＜0.01），CC10处理明显抑制嗜酸性粒细胞增加（P＜0.05）。杯状细胞计数显示AR组小鼠上皮杯状细胞明显多于对照组（P＜0.01），CC10处理明显抑制杯状细胞增加（P＜0.05，图2）。

2.3 CC10降低IL-5和IL-17细胞因子水平AR组小鼠NLF中IL-5、IL-17水平较对照组显著升高（P＜0.05），IFN-γ水平差异无统计学意义，CC10处理后，IL-5、IL-17水平明显降低（P＜0.05，图3）。

图1 各组小鼠搔鼻次数比较Fig.1 Comparison of nasal rubs among different groups

图2 各组小鼠NLF中嗜酸性粒细胞及上皮中杯状细胞比较（×200）Fig.2 Comparison of eosinophils and goblet cells in NLF of mice in different groups（×200）

图3 各组小鼠NLF中IL-5、IL-17及IFN-γ表达比较Fig.3 Comparison of levels of IL-5，IL-17 and IFN-γin NLF of mice in different groups

图4 各组小鼠鼻黏膜FOXP3及NLF中TGF-β1及IL-10表达比较Fig.4 Comparison of levels of FOXP3 in nasal mucosa and TGF-β1，IL-10 in NLF of mice in different groups

2.4 CC10促进小鼠鼻黏膜FOXP3表达及NLF中TGF-β1、IL-10表达与对照组相比，AR组小鼠FOXP3 mRNA表达增强（P＜0.05），CC10处理显著增强其表达。对照组和AR组小鼠IL-10和TGF-β1水平差异无统计学意义，而CC10治疗组小鼠IL-10和TGF-β1水平显著升高（P＜0.05，图4）。

3 讨论

本研究首次发现CC10可减轻AR小鼠临床症状，同时减轻鼻黏膜局部嗜酸性粒细胞浸润，减少杯状细胞增生，降低Th2和Th17反应，但增加Tregs反应。

CC10是一种抗炎蛋白，参与调节气道疾病发展［9］。最近研究表明，CC10可抑制AR模型中Th17反应［10］。本研究发现OVA激发导致AR小鼠气道嗜酸性粒细胞浸润和杯状细胞增生，CC10可显著改善AR小鼠以上病理学特征，与课题组前期研究结果一致。CC10可显著降低IL-5和IL-17水平，而对IFN-γ无影响，提示CC10对Th2和Th17细胞具有抑制作用。课题组前期研究发现，CC10在致敏阶段可通过降低树突状细胞OX40配体、IL-6和IL-23表达而抑制Th17反应，但同时促进树突状细胞TGF-β1和CD86表达［10］。而在激发阶段，CC10可降低鼻黏膜局部CCL20和IL-23表达。因此，CC10的作用机制尚不清楚，有待进一步研究。

迄今为止，不同过敏原特异性T细胞亚型（Th1、Th2、Th17和Tregs）已被证实与过敏性气道疾病有关［11］。T辅助细胞和Tregs失调可导致过敏性疾病发展［11］。研究表明，外周Tregs在控制T细胞反应方面起关键作用［12］。人类和动物模型中，Tregs缺失或功能缺陷与过敏性气道疾病、自身免疫性疾病和癌症相关［12］。已知的Tregs亚群中，有两个Tregs亚群受到了特别关注，即胸腺中自然产生的Tregs和外周产 生 的Tregs［13］。外 周 产 生 的Tregs还 包 括Tr1和Th3两个细胞亚群，其特征分别为分泌IL-10和TGF-β1［14］。本研究表明，CC10可显著增加AR小鼠鼻黏膜局部FOXP3表达，CC10治疗后IL-10和TGFβ1水平显著升高。本研究表明Tregs在CC10的免疫调节和抗炎作用中发挥重要作用。

研究表明吲哚胺-2，3-双加氧酶（IDO）、TGF-β1、IL-10和前列腺素E2（PGE2）等分子决定了Tregs分化［15-16］。本研究观察到CC10显著增加AR小鼠鼻黏膜中TGF-β1和IL-10表达，提示TGF-β1和IL-10可能是CC10影响AR小鼠Tregs扩增的主要因素。由于CC10在气道疾病中具有较强抗炎作用，课题组推测其可能通过增强IDO和PGE2表达促进T调节反应，但还需进一步阐明。

总之，CC10可能通过调控T细胞反应改善AR小鼠鼻腔炎症状态，具体机制还需进一步研究。