系统性红斑狼疮外周血T淋巴细胞PD-1和Tim-3表达和意义①

罗 清 黄自坤 李 雪 李俊明（南昌大学第一附属医院检验科，南昌 330006）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种多因素自身免疫病，严重危害人类健康，其特征为出现多种自身抗体（anti-dsDNA、anti-Sm、anti-nucleosome等），补体活化和免疫复合物沉积造成多个组织器官损伤，进而出现多样化的临床症状［1］。临床研究证实，虽然目前出现新型的生物制剂和更有效的SLE治疗策略，但其缓解率仍不高，造成这种状况的原因之一是SLE病因及发病机制尚未完全被解析。研究表明，T淋巴细胞在多个方面参与SLE发病过程［2-4］。

近年来，共刺激分子在SLE免疫应答中的作用受到研究者极大关注，尤其是PD-1（programmed death 1）和Tim-3（T cell Ig and mucin domaincontaining molecule 3）。一方面有证据显示，SLE患者免疫细胞上异常表达的PD-1可参与疾病的发生发展［5-7］；另一方面研究表明，异常表达的Tim-3参与SLE致病［8-9］。近期，有研究者提出，肿瘤浸润T淋巴细胞上共表达PD-1与Tim-3的百分比与肿瘤的侵袭表型和肿瘤大小有关［10］。此外，有研究显示，PD-1和Tim-3中位数以上的共表达可增加复发风险，且36个月的总生存率较差［10］。目前，对于SLE患者T淋巴细胞表面上PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3-的表达情况，以及PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3-表达与临床指标的相关性尚不清楚。本研究通过检测SLE患者和健康对照者外周血T淋巴细胞表面PD-1和Tim-3的共表达（包括平均荧光强度和百分比），分析其与自身抗体、实验室指标、临床表现、治疗的关系，探讨PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3-T淋巴细胞在SLE中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料41例SLE患者来自于南昌大学第一附属医院风湿免疫科2017年6月至2017年12月就诊的患者，其中男3例，女38例，平均年龄（40.0±15.6）岁，临床诊断符合美国风湿病学会（ARA）1997年修订的分类标准，并排除糖尿病、心脑血管疾病、血栓性疾病等其他严重疾病患者。健康对照组33例，均为健康志愿者，排除其他自身免疫性疾病和炎症，男2例，女31例，平均年龄（41.0±9.8）岁。SLE疾病组与健康对照组（HC）年龄、性别差异无统计学意义。详细收集SLE患者临床资料及相关实验室检查数据，并计算其SLE疾病活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）。本实验经南昌大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂和仪器流式细胞抗体异硫氰酸荧光素标记的PD-1抗体（fluorescein isothiocyanate-PD-1，FITC-PD-1）和藻红蛋白标记的Tim-3抗体（phycoerythrin-Tim-3，PE-Tim-3）购自美国eBioscience公司；藻红蛋白-得克萨斯红标记的CD3抗体（phycoerythrintexas red，ECD-CD3）及相应的同型对照PEIgGl、FITC-IgGl和ECD-IgGl均购自美国Beckman-Coulter公司；Cytomics FC 500流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；分析软件为仪器自带的CXP分析系统。

1.2 方法

1.2.1 SLE治疗41例SLE患者中6例治疗前抽取空腹EDTA抗凝静脉血用于流式细胞术检测。SLE患者根据病情严重程度选取治疗方案：①病情轻度活动（SLEDAI＜9分）者用泼尼松或糖皮质激素+羟氯喹/甲氨蝶呤/来氟米特治疗；②病情中度活动（SLEDAI 10～14分）者用糖皮质激素+环磷酰胺/霉酚酸酯治疗；③病情重度活动（SLEDAI≥15分）者先用糖皮质激素冲击加环磷酰胺，再按病情中度活动治疗方案治疗。入选的6例SLE患者至少治疗1周后抽取患者空腹EDTA抗凝静脉血用于流式细胞检测。

1.2.2 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）提取采集SLE患者和健康对照者2 ml清晨空腹EDTA抗凝外周血，6 h内送检。采用密度梯度离心法分离获取PBMC，把分离获取的PBMC用生理盐水洗涤后重悬备用。

1.2.3 流式细胞术检测人外周血CD3+T淋巴细胞PD-1和Tim-3表达各取100µl重悬的PBMC加入2支试管，分别加入3种单克隆抗体FITC-PD-1、ECD-CD3、PE-Tim-3和相应的同型对照各10µl，4℃避光孵育30 min，加入1 ml生理盐水，室温1 500 r/min离心5 min，弃上清，生理盐水洗涤1次，用500µl生理盐水重悬上机检测；Cytomics FC 500流式细胞仪进行分析，CXP分析软件检测CD3+T淋巴细胞PD-1和Tim-3表达水平。

1.3 统计学处理分析运用SPSS17.0软件对数据进行描述和分析。首先进行正态性检验，符合正态分布数据，两组间比较采用t检验，否则采用非参数检验。两变量相关性采用Spearman相关分析。SLE患者治疗前后以配对t检验分析组间差异，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE患者组和健康对照组外周血T淋巴细胞PD-1和Tim-3表达水平比较采用流式细胞术分别检测T淋巴细胞（CD3+）PD-1和Tim-3的表达水平，结果如图1所示，SLE患者组PD-1+T淋巴细胞百分比显著高于健康对照组，分别为（33.77±17.59）%和（22.76±12.87）%，差异有统计学意义（t=3.0，P=0.004）；SLE患者组T淋巴细胞PD-1表达的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）显著高于健康对照组，分别为3.19±2.02和1.71±0.34，差异有统计学意义（U=110.5，P＜0.001）；SLE患者组Tim-3+T淋巴细胞百分比显著高于健康对照组，分别为（8.03±12.41）%和（2.21±3.22）%，差异有统计学意义（U=325.5，P＜0.001）；SLE患者组和健康对照组的T淋巴细胞Tim-3表达的MFI分别为3.22±2.43和2.86±1.69，差异无统计学意义（U=557.5，P=0.198）。

2.2 SLE患者组和健康对照组外周血PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及其PD-1、Tim-3表达MFI比较根据T淋巴细胞上PD-1和Tim-3表达可将其分为3群，分别为PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞。如图2所示，SLE患者组PD-1+Tim-3-T淋巴细胞百分比显著高于健康对照组，分别为（31.80±16.02）%和（21.97±12.26）%，差异有统计学意义（t=2.9，P=0.005）；SLE患者组PD-1+Tim-3+T淋巴细胞百分比显著高于健康对照组，分别为（4.00±6.26）%和（0.62±1.05）%，差异具有统计学意义（U=247.0，P＜0.001）；SLE患者组PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比显著高于健康对照组，分别为（4.18±7.34）%和（1.55±2.49）%，差异具有统计学意义（U=403.5，P=0.003）。进一步分析这3群细胞PD-1和Tim-3表达的MFI，发现SLE患者组PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达的MFI显著高于健康对照组，分别为3.06±1.93和1.68±0.31，差异有统计学意义（t=2.9，P＜0.001）；而PD-1+Tim-3+T淋巴细胞PD-1、Tim-3表达的MFI和PD-1-Tim-3+T淋巴细胞PD-1表达的MFI差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 SLE患者组PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与自身抗体的关系SLE患者血清中可出现anti-dsDNA、anti-Sm、anti-nucleosome、anti-SSA、anti-Ro52、anti-RIB-P等自身抗体，分析SLE患者组PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及其PD-1、Tim-3表达MFI与SLE患者自身抗体的关系表明：如图3所示，anti-nucleosome阳性的SLE患者PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI明显高于阴性者，分别为4.41±3.01和2.51±0.67，差异有统计学意义（U=72.0，P=0.005）；anti-Ro52阳性的SLE患者PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比明显高于阴性者，分别为（5.85±9.31）%和（1.99±1.98）%，差异有统计学意义（U=121.5，P=0.044）；而未见以上指标与其他自身抗体存在关系。

图1 SLE患者和健康对照组外周血T淋巴细胞PD-1和Tim-3表达Fig.1 Expressions of PD-1 and Tim-3 on peripheral T lymphocyte from SLE patients and HC

2.4 SLE患者组PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI相关性分析将能反映SLE疾病严重程度和活动性的相关指标（SLEDAI、ESR、CRP、IgG、C3、C4、WBC、RBC、RDW、HGB、HCT、PLT、MPV、PCT、PDW、L、L%、M、M%、N、N%、NLR、PLR、LMR等）与SLE患者PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI进行相关性分析，如图4所示，PD-1+Tim-3+T淋巴细胞百分比与L呈负相关（rs=-0.404，P=0.009）；PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与WBC（rs=-0.399，P=0.010）、RBC（rs=-0.615，P＜0.001）、HGB（rs=-0.571，P＜0.001）、HCT（rs=-0.602，P＜0.001）、L（rs=-0.403，P=0.009）、N（rs=-0.348，P=0.026）、C3（rs=-0.400，P=0.011）、C4（rs=-0.324，P=0.041）呈负相关，与PLR（rs=0.369，P=0.018）、RDW（rs=0.318，P=0.043）呈正相关。而未发现PD-1+Tim-3-、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比与以上指标相关。

图2 SLE患者和健康对照组外周血PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及其PD-1、Tim-3表达MFI水平Fig.2 Percentage of PD-1+Tim-3-，PD-1+Tim-3+，PD-1-Tim-3+T lymphocyte and MFI of PD-1，Tim-3 on these cells from SLE patients and HC

图3 PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与自身抗体的关系Fig.3 Correlation of MFI of PD-1 on PD-1+Tim-3-T lymphocyte in SLE patients with autoantibody

图4 PD-1+Tim-3+T淋巴细胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与SLE患者实验室指标的关系Fig.4 Correlation of percentage of PD-1+Tim-3+T lymphocyte，MFI of PD-1 on PD-1+Tim-3-T lymphocyte in SLE patients with laboratory index

图5 PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与SLE患者临床表现的关系Fig.5 Correlation of MFI of PD-1 on PD-1+Tim-3-T lymphocyte in SLE patients with clinical features

2.5 SLE患者组PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与临床表现的关系分析SLE患者组PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与临床表现的关系发现，如图5所示，低红细胞血症组SLE患者PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI明显高于阴性者（U=61.0，P＜0.001）；贫血组SLE患者PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI明显高于阴性者（U=68.0，P=0.002）。并未发现PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比与临床表现相关。

2.6 SLE患者组PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与治疗的关系6例SLE患者根据正规治疗至少1周后，比较治疗前后SLE患者组PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比及其PD-1、Tim-3表达MFI水平，如图6所示，治疗后SLE患者PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI明显低于治疗前，差异具有统计学差异（U=68.0，P=0.031），而未见其他指标与治疗存在关系。

3 讨论

SLE是一种病因与发病机制不明的自身免疫性疾病。PD-1和Tim-3是近年来受广大研究者关注的两种新型负性共刺激分子，已有研究表明PD-1、Tim-3均在SLE发生发展中发挥重要作用，但对于PD-1和Tim-3共表达在SLE中的作用却鲜有报道。本研究同时对SLE患者和健康对照者外周血T淋巴细胞表面PD-1和Tim-3表达进行检测，结果发现纳入分析的两组研究对象外周血T淋巴细胞表面总PD-1和Tim-3的表达水平均不相同，SLE组患者T淋巴细胞PD-1（百分比和MFI）和Tim-3（百分比）表达水平显著高于健康对照组；SLE组患者PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+、PD-1-Tim-3+T淋巴细胞百分比以及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达的MFI显著高于健康对照组，且SLE组患者PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达的MFI水平与抗体含量呈正相关，提示PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达的MFI水平越高，患者体内的自身抗体越多，SLE病情越活跃。进一步研究发现，SLE患者外周血PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达的MFI水平与WBC、RBC、HGB、HCT、L、N、C3、C4呈负相关，与PLR、RDW呈正相关，且与SLE患者的临床表现和治疗相关。

图6 PD-1+Tim-3-T淋巴 细胞PD-1表达MFI与SLE患者治疗的关系Fig.6 Correlation of MFI of PD-1 on PD-1+Tim-3-T lymphocyte in SLE patients with treatment

Tim-3是细胞免疫应答的关键细胞因子，表达于多种免疫细胞表面。已有研究表明SLE患者外周血淋巴细胞Tim-3表达明显升高，且与疾病严重程度及INF-γ表达相关［11-12］。亦有研究表明SLE患者血清和单个核细胞Tim-3表达明显降低，且与疾病严重程度呈负相关［13-14］。以上研究表明，虽然Tim-3参与SLE致病，但其功能涉及的机制并不一致。而本研究表明SLE患者外周血淋巴细胞总Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3+T淋巴细胞百分比明显升高，但Tim-3表达的MFI在疾病组与健康对照组间并未存在差异。已有研究证实Tim-3阳性的CD4/CD8/CD14等免疫细胞百分比在SLE中存在差异，但并未显示Tim-3表达的MFI情况，有可能是Tim-3表达的MFI差异无统计学意义，与本文研究结论一致［8-9，11］；但也有可能是研究者并未分析CD4/CD8/CD14等免疫细胞MFI是否存在差异，而本文仅研究总CD3+T细胞上的Tim-3表达情况，因此有必要进一步探讨各T细胞亚群中Tim-3表达MFI。此外，本研究并未发现总Tim-3+、PD-1-Tim-3+、PD-1+Tim-3+T淋巴细胞百分比与SLE患者的疾病严重程度存在明显相关性。因此，Tim-3在SLE中的具体机制还需进一步研究。

PD-1作为一种负性共刺激分子，可向免疫细胞传导负性信号，抑制T细胞增殖和细胞因子分泌参与SLE致病［15］；也可作为辅助性T细胞上的功能分子促进B细胞、浆细胞活化增殖以及致病性自身抗体的产生，从而参与SLE致病［16］。本研究综合分析SLE患者外周血T淋巴细胞PD-1和Tim-3共表达情况发现总PD-1+、PD-1+Tim-3-、PD-1+Tim-3+T淋巴细胞百分比及PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达的MFI明显升高，且升高的PD-1+Tim-3-T淋巴细胞PD-1表达MFI与自身抗体、疾病严重程度、临床表现以及治疗呈正相关，表明T细胞上高表达的PD-1并非以负性共刺激分子发挥抑制作用，而是以其他方式参与SLE发病。

近期，有研究表明共表达共刺激分子PD-1和Tim-3的肿瘤浸润T淋巴细胞与肿瘤发生发展及预后相关［10，17-18］。本研究首次探讨SLE患者外周血T淋巴细胞PD-1和Tim-3的共表达情况，结果发现PD-1+Tim-3+T淋巴细胞百分比明显高于健康对照组，且升高PD-1+Tim-3+T淋巴细胞百分比与L呈负相关，表明PD-1和Tim-3的共表达可能与淋巴细胞的耗竭有关，但具体作用机制还需进一步探索。