香栓菌抑制NLRP3炎症小体活化改善过敏性鼻炎①

赵晶晶 包海鹰（吉林农业大学中药材学院，长春 130118）

过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是机体受到过敏原刺激后，临床表现以鼻部症状为主的慢性非感染性炎症性疾病。AR临床表现为打喷嚏、流鼻涕、鼻塞、鼻痒等症状，可伴有嗅觉减退或消失，并引起鼻息肉、鼻窦炎等多种并发症［1-2］。据统计，AR影响着全球10%～40%的人口。根据过敏原可分为常年性过敏性鼻炎（perennial allergic rhinitis，PAR）和季节性过敏性鼻炎（seasonal allergic rhinitis，SAR），而SAR大多是由植物释放的花粉过敏原导致的［3］。目前，豚草已入侵我国的大部分地区，豚草花粉成为引起SAR的主要致敏花粉［4］。研究表明，炎症小体与多种炎症疾病的发生有关［5］。NOD样受体蛋白结构域3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体是由NLRP3、接头蛋白凋亡相关点样蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing CARD,ASC）和半胱天冬酶1（Caspase-1）组成的、存在于细胞内的一种复合体，在促进炎症反应中发挥重要作用。某些过敏原可诱导NLRP3炎症小体激活，如豚草花粉可诱导人鼻黏膜上皮细胞中NLRP3炎症小体活化，增强IL-1β的表达［6］。

香栓菌（Trametes suaveolensL.Fr.）是一种生长在杨柳树上的大型药用真菌［7］。经考证，香栓菌为古籍中所记载的“白芝”，《本草纲目》中记载，白芝主治咳逆上气，宜肺气，通利口鼻，强志意，勇悍，安魄［8］。现代药理学研究发现，香栓菌具有抗过敏性哮喘的作用，能显著降低小鼠体内IL-1β、IL-6水平，其机制可能是通过调节机体免疫应答起到治疗过敏性哮喘的作用［9］。古籍中记载具有宜肺气、通利口鼻之功效的香栓菌对AR的作用尚未阐明，本研究通过采用豚草花粉构建SAR小鼠模型，研究香栓菌不同提取物对SAR小鼠是否能通过抑制NLRP3炎症小体活化，起到对SAR的防治作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级6周龄雌性C57BL/6J小鼠90只，体质量（20±2）g，标准环境下适应性饲养7 d，实验期间自由饮水进食［由北京华阜康生物科技有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2019-0008］。

1.1.2 实验试剂香栓菌Trametes suaveolens子实体采自吉林农业大学校园柳树，经吉林农业大学食药用菌工程中心图力古尔教授鉴定；豚草花粉采于吉林农业大学校园内，经吉林农业大学包海鹰教授鉴定；氯雷他定片（青岛双鲸药业股份有限公司，批号：H20040498）；RIPA裂解液（武汉Servicebio公司，货号：G2002）；BCA蛋白定量检测试剂盒（武汉Servicebio公司，G2026）；β-actin（GB12001）、Caspase-1（GB11383）、IL-18（10663-1-ap）、IL-1β（A11369）抗体（武汉Servicebio公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同提取物的制备香栓菌子实体晾干后粉碎，取1 kg香栓菌粉末加入4 000 ml石油醚，回流提取3次，每次8 h，滤液浓缩真空干燥即得香栓菌石油醚提取物。将药渣挥干，继续加入4 000 ml蒸馏水回流提取3次，每次2 h，滤液浓缩干燥即得香栓菌水提物。香栓菌水提物加入适量蒸馏水超声溶解，加入无水乙醇调至醇浓度为85%，4℃静置过夜，4 000 r/min离心10 min，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤2次，离心，干燥即得香栓菌粗多糖。

1.2.2 豚草花粉变应原的制备豚草花粉5 g，混于50 ml PBS中，4℃振荡提取12 h，混悬液1 500 r/min离心10 min，取上清，采用BCA法测定蛋白含量，调整蛋白终浓度为8 mg/ml，备用［10］。

1.2.3 构建小鼠SAR模型将小鼠随机分为9组：空白组（NC）、模型组（SAR）、氯雷他定组（LT）、水提物高（TSWH 240 mg/kg）、低（TSWL 60 mg/kg）剂量组、石油醚高（TSPEH 24 mg/kg）、低（TSPEL 6 mg/kg）剂 量 组、多 糖 高（TSDH 400 mg/kg）、低（TSDL 100 mg/kg）剂量组，每组10只。将50µl豚草花粉变应原和等量弗氏佐剂混合，于第1、8、15天对小鼠进行腹腔注射200µl致敏，空白组给予生理盐水。第21～28天进行滴鼻激发，用0.5%豚草花粉变应原生理盐水滴于小鼠双侧鼻腔中，每侧10µl。滴鼻前1 h灌胃给予各提取物，空白组和模型组给予生理盐水。

1.2.4 SAR模型小鼠行为学评价末次给药后1 h，采用豚草花粉对小鼠进行滴鼻激发，观察小鼠15 min内挠鼻和打喷嚏的次数。采用叠加量化法计分法记录症状积分［11］，症状积分≥5分者为造模成功，AR症状分级评分标准见表1。

1.2.5 小鼠血清及鼻腔灌洗液中炎症指标的检测在末次小鼠鼻部行为学观察后2 h，通过眼球取血的方式采集小鼠血液，离心取血清；用1 ml注射器吸取0.8 ml生理盐水注射于小鼠鼻腔中，下方放置1 ml离心管接取鼻腔流出液体，收集小鼠鼻腔灌洗液。根据ELISA试剂盒说明书分别测定小鼠血清中IgE、IL-1β、IL-18和鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β、IL-18水平。

1.2.6 鼻黏膜组织学形态评价分离小鼠鼻部皮肤、肌肉和软组织，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，10%EDTA脱钙液脱钙14 d，石蜡包埋，切成4µm厚的切片，进行HE染色，光学显微镜下分析炎症细胞浸润情况。

1.2.7 Western blot检测将小鼠鼻黏膜组织在含有完整蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中进行裂解，12 000 r/min离心10 min，收集上清。参照试剂盒方法，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度后上样。转膜，用含5%脱脂乳的TBST封闭2 h。然后将膜与NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18和β-actin一抗（1∶1 000稀释）在4℃下孵育过夜，随后与山羊抗兔IgG二抗（1∶3 000稀释度）在室温下孵育1 h。使用ECL化学发光试剂盒进行显影。

表1 小鼠行为学症状评分标准Tab.1 Norm of behavioral symptom score in mice

1.3 统计学分析利用SPSS20.0统计软件分析数据，血清及鼻腔灌洗液中炎症细胞因子采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学评价于末次给药后1 h，采用豚草花粉对小鼠进行滴鼻激发，观察小鼠挠鼻和打喷嚏的次数。空白组小鼠无打喷嚏，偶尔出现挠鼻行为；与空白组相比，模型组出现打喷嚏，剧烈挠鼻的行为，行为学评分显著高于空白组（P＜0.05）；与模型组相比，各提取物高剂量组小鼠症状评分均显著低于模型组（P＜0.05）。其中TSPEH组行为学评分最低，与氟雷他定组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 香栓菌对小鼠血清中IgE、IL-1β、IL-18及鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β、IL-18水平的影响与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-1β、IL-18及IgE水平均显著升高（P＜0.05），鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-18及IL-6水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，各提取物高剂量均能显著降低小鼠血清和鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-18和IL-6水平（P＜0.05），TSWH和TSDH均能降低小鼠血清中IgE水平（P＜0.05）。见表2、表3。

2.3 香栓菌提取物对SAR小鼠鼻黏膜组织病理学的影响HE染色结果表明，空白组基本无炎症细胞浸润，模型组出现较为严重的炎症细胞浸润；与模型组相比，各提取物高剂量组及氟雷他定组病理学症状减轻，炎症细胞浸润减少，其中TSPEH组效果最为明显；提取物低剂量组对小鼠鼻黏膜病理症状改善不明显。见图2。

图1 小鼠行为学评分对比Fig.1 Comparison of behavioral score in mice

2.4 香栓菌提取物对小鼠鼻黏膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β蛋白表达的影响与空白组相比，模型组鼻黏膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达水平均升高（P＜0.05），与模型组相比，TSPE高剂量组中NLRP3、IL-18、IL-1β、Caspase-1蛋白表达均显著下调（P＜0.05）。见图3。

表2 香栓菌提取物对血清中细胞因子水平的影响（±s，n=10，ng/L）Tab.2 Effect of Trametes Suaveolens fruiting body extract on cytokine of serum（±s，n=10，ng/L）

表2 香栓菌提取物对血清中细胞因子水平的影响（±s，n=10，ng/L）Tab.2 Effect of Trametes Suaveolens fruiting body extract on cytokine of serum（±s，n=10，ng/L）

Note：1）P＜0.05 vs NC group；2）P＜0.05 vs SAR group.

Groups NC SAR LT TSDL TSDH TSWL TSWH TSPEL TSPEH IL-1β 66.37±1.66 113.32±1.761）97.52±1.342）90.18±1.412）80.18±1.682）113.60±3.90 92.72±2.772）101.64±0.18 72.87±2.572）IL-18 110.47±3.95 184.70±7.191）92.06±0.552）160.52±0.96 147.42±0.842）153.86±2.89 109.24±4.072）141.70±5.40 129.73±4.432）IgE 6.17±0.12 10.29±0.281）8.69±0.272）11.21±0.24 8.66±0.122）10.92±0.16 8.75±0.212）11.52±0.08 9.40±0.16

表3 香栓菌提取物对鼻腔灌洗液中细胞因子水平的影响（±s，n=10，ng/L）Tab.3 Effect of Trametes Suaveolens fruiting body extract on cytokine of nasal lavage fluid（±s，n=10，ng/L）

表3 香栓菌提取物对鼻腔灌洗液中细胞因子水平的影响（±s，n=10，ng/L）Tab.3 Effect of Trametes Suaveolens fruiting body extract on cytokine of nasal lavage fluid（±s，n=10，ng/L）

Note：1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs NC group；3）P＜0.05，4）P＜0.01 vs SAR group.

Groups NC SAR LT TSDL TSDH TSWL TSWH TSPEL TSPEH IL-1β 81.14±17.22 153.35±22.551）112.73±8.823）108.85±9.743）106.37±11.293）125.17±16.673）121.74±14.093）126.23±21.253）121.97±19.313）IL-18 56.31±8.33 107.79±12.082）71.06±6.923）95.36±10.28 75.09±10.923）85.22±10.303）77.37±5.543）92.40±10.18 77.22±9.163）IL-6 56.24±8.24 92.97±10.851）68.25±12.013）75.90±13.913）74.72±12.244）81.94±11.36 71.03±14.253）87.93±12.02 68.46±3.913）

图2 香栓菌提取物对小鼠鼻黏膜病理组织学的影响（×200）Fig.2 Effects of Trametes suaveolens fruiting body extract on nasal mucosa hyphological changes of mice（×200）

图3 香栓菌提取物对各组小鼠鼻黏膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达的影响Fig.3 Effects of Trametes suaveolens fruiting body extract on NLRP3，Caspase-1，IL-1βand IL-18 expressions in nasal mucosa tissue of mice

3 讨论

目前，AR在全球具有较高的发病率，而且较难治愈，其中SAR的发病率也在逐年增高，目前临床有效的治疗方法一般为鼻内滴注皮质类固醇或组胺类药物［12］，然而，在有效减轻SAR症状的同时，也会产生一系列的副作用，导致机体免疫功能下降等，同时使机体产生一定的耐药性。SAR多发生于7月中旬至10月上旬，主要由植物所释放的花粉过敏原所导致，其中豚草花粉为引起我国东北地区SAR的过敏原之一。当人体吸入豚草花粉后，会出现鼻痒、流鼻涕、打喷嚏等症状，严重影响患者生活质量［13］。因此，寻找具有良好预防和治疗作用且副作用小的天然药物受到广泛关注。

香栓菌为古籍中所记载的“白芝”，归肺经，具有咳逆上气，宜肺气，通利口鼻等功效。同时前期对香栓菌的药理活性研究发现，香栓菌可通过调节机体免疫应答，阻止B细胞的分化和T细胞的活化增殖，抑制炎症反应的发生，从而起到治疗过敏性哮喘的作用［9］。本研究采用豚草花粉对小鼠进行全身致敏及局部激发构建SAR模型，结果显示，SAR组在滴鼻激发后出现SAR症状，如挠鼻、打喷嚏、流鼻涕等症状，并随着激发次数增多而症状加重，行为学评分＞5分，空白组偶有挠鼻现象，表明SAR模型构建成功。香栓菌各提取物组给药后，小鼠SAR症状明显减轻，行为学评分显著低于SAR组，表明香栓菌提取物可有效减轻小鼠SAR症状。

研究发现，NLRP3炎症小体介导的炎症反应在AR的发展中发挥重要作用，NLRP3炎症小体由NLRP3、Caspase-1、ASC组合而成［14］。通常NLRP3处于自身抑制状态，当感知细胞内的病原微生物和代谢物时，便会激活Caspase-1，活化后的Caspase-1可促进Pro-IL-1β和Pro-IL-18加工成具有活性的IL-1β和IL-18释放至细胞外发挥免疫调节作用［15］。YANG等［16］在OVA诱导的AR小鼠模型中，NLRP3炎症小体活化可促进其下游炎症因子IL-18及IL-1β的分泌，敲除NLRP3和抑制Caspase-1可有效缓解AR炎症反应，抑制上皮细胞发生焦亡，保护小鼠鼻黏膜结构的完整性。同时，IL-18、IL-1β具有促进嗜酸性粒细胞生成的作用［17］。本研究结果显示，SAR组小鼠鼻黏膜组织中NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著升高，其下游炎症因子IL-18、IL-1β蛋白表达显著上调，提示NLRP3炎症小体介导的炎症反应参与了豚草花粉诱导的SAR小鼠发病进程。香栓菌石油醚提取物及水提物组中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表达均显著低于模型组，表明香栓菌提取物抑制NLRP3炎症小体活化，从而阻止炎症反应发生。香栓菌水提物及石油醚提取物均能降低小鼠血清及鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-18炎症因子水平，提示IL-18、IL-1β局部及全身均有升高可能与调节嗜酸性粒细胞从骨髓募集至鼻腔有关。IgE在致敏性疾病中的作用尤为重要，TSWH和TSDH均能降低小鼠血清中IgE水平，表明IgE参与了SAR发病进程［18］。NLRP3炎症小体的活化可促进IL-6的释放并加重炎症反应［19］。香栓菌各提取物均能降低NALF中IL-6水平，表明香栓菌提取物参与了抑制NLRP3的活化。HE病理切片结果显示，香栓菌石油醚高剂量组炎症细胞浸润减少，鼻黏膜组织相对完整，表明香栓菌石油醚提取物可减轻局部炎症反应。

综上所述，香栓菌石油醚提取物可有效改善豚草花粉诱导SAR小鼠症状，本文体内实验证实了NLRP3炎症小体参与了SAR炎症反应进程，其机制可能为通过抑制NLRP3炎症小体的活化，减少与NLRP3炎症小体下游相关的炎症因子IL-18、IL-1β的释放，减轻了小鼠鼻黏膜组织中嗜酸性粒细胞的浸润情况，从而减轻小鼠SAR炎症反应。