中性粒细胞胞外诱捕网的形成与调控

欧阳慧敏 ， 李锦宏 ， 郭建波 ， 孙 逊 ， 李欣然，2 ， 曹嫦妤，2

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院 ， 广东 佛山 528225 ；2.佛山科学技术学院附属教学动物医院 ， 广东 佛山 528225)

中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞参与免疫防疫的重要途径。科学家最初认为NETs作为中性粒细胞的一种防御手段，有助于宿主的先天免疫，还可以捕杀金黄色葡萄球菌、白色念珠菌酵母相和菌丝相等多种病原体，起到免疫抗菌的作用，防御病原体入侵；随着研究的深入，研究者发现NETs有“双刃剑”的作用：当机体不能保证NETs产生和降解平衡时，NETs可能反过来作为自身抗原，引发机体免疫反应，参与自身免疫性疾病[1-2]、肿瘤[3]和炎性疾病[4-5]等的发生或发展过程，导致机体组织受损。NETs对马、奶牛、猪以及伴侣动物疾病的预防和诱发过程都有影响。本文从NETs的形成和调控、疾病的预防和诱发进程等方面予以综述，旨在为兽医研究NETs的作用机制和药物靶向应用提供一定的科学依据。

1 NETs的形成

2004年，Brinkmann等[6]发现，在白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)、肉豆蔻酸佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)以及脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激后，中性粒细胞中形成了特殊的网状结构，通过高分辨率扫描电镜观察发现其是以DNA为骨架结构，并固定有各种蛋白颗粒的纤维网状，命名为NETs，这种结构的形成过程称为NETosis。NETosis是一种不同于坏死和凋亡的中性粒细胞新型死亡方式[7-8]。早期研究发现，NETs的构成包含髓过氧化酶(Myeloperoxidase，MPO)、组织蛋白酶G(Cathepsin G，CTSG)、中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)等颗粒蛋白[9]。随着研究深入，科学家进一步发现了NETs组成中除颗粒蛋白外的其他蛋白成分。且采用不同的NETs收集程序或蛋白质鉴定技术检测出的蛋白组分略有差异。这些组分与NETs在动物疾病中的生理作用密切相关。

中性粒细胞是机体先天免疫的重要参与者，研究发现NETs的形成(NETosis)是中性粒细胞清除病原的有效途径。NETs的形成主要依赖于葡萄糖糖酵解，一定程度上依赖谷氨酰胺、腺膘呤核苷三磷酸(ATP)和酶[10]。当中性粒细胞受微生物、细菌产物、化学试剂等刺激活化后，可以通过2种途径启动NETosis，一种是经典型的NETosis，主要由NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)介导产生活性氧(ROS)，引起氧化应激，线粒体能量产生和代谢障碍，细胞核空泡化，最终细胞内染色质解聚，质膜解体[11]。另一种类型的NETosis是NOX非依赖型，是由电压依赖性钙激活的钾通道3(SK3)的开放支持[12]，其发生与生长因子、细胞因子和热休克蛋白等细胞外刺激关系密切(封二图1)[11]。

图1 NRTSD的形成[11],[13]

2 NETs形成的调控

NETs的发生与动物疾病病理过程相关，而不同诱导方式最终产生的NETs有差异，这可能是由于NETosis涉及多种不同的信号转导机制所导致[14]。这些生物学信号转导途径可能对NETs的生物学效应有不同影响，是目前研究调控NETs对相关疾病影响和新治疗策略的着力点。

组蛋白瓜氨酸化(Citrullinated histone H3，H3Cit)被认为是体内和体外诱导后NETosis形成的关键早期步骤，评估早期H3Cit水平可作为预测后期NETosis的指标，是NETs形成的生物标志物之一[15]。Gavillet等[16]通过对条件基因敲除小鼠使用离子霉素和PMA诱导后检测纯化多形核中性粒细胞NETosis及H3Cit水平变化的研究，发现Vav/Rac/Pak信号级联影响NETs的形成；Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)和Ras相关的C3肉毒素底物2(Rac2)基因缺失后小鼠多形核中性粒细胞基础H3Cit水平显著降低，经离子霉素和PMA诱导的NETosis显著减少；Rac的激活剂Vav1和Vav3的联合缺失也可以在一定程度上减少NETosis；Pak是Rac的效应器，主要通过其N端调节黏附区的p21结合域与上游调节器Rac相互作用从而使Rac/Pak信号转导激活；使用Pak抑制剂IPA-3和PF-3758309处理，均可以减少NETosis，并且IPA-3在5 μmmol/L水平抑制Pak时，可几乎完全消除离子霉素和PMA诱导的NETosis。表明Rac和Pak信号转导是调节NETs形成的一个有效通路。

P-选择素的信号也可以介导NETs的形成。用凝血酶激活的血小板与中性粒细胞也可共同诱导NETosis。而血小板-中性粒细胞的相互作用主要是由P-选择素介导的细胞间的相互影响。P-选择素是一种糖蛋白，存在于血管内皮细胞的棒杆状Weibel-Palade小体的小体膜及血小板α颗粒膜上。其配体是唾液酸化路易斯，高亲和力的配体是P-选择素糖蛋白配体1，主要表达于中性粒细胞和单核细胞。Etulain等[17]通过小鼠体外诱导试验发现P-选择素激活中性粒细胞整合素，活化血小板参与NETosis。P-选择素相关的信号建立对血小板诱导NETs的形成有调控作用。

不同诱导因素对NETosis影响不同，造成NETs生成量不同，NETs形成能力或水平高低与许多生理病理过程有关。可利用脱氧核糖核酸酶I(Deoxyribonuclease I，DNase I)加强NETs的降解，或直接将NETs和疾病相互作用的信号转导途径、介导因子作为靶标对NETs生成进行调控。

3 NETs参与机体免疫过程

当机体内NETs生成和降解达到平衡，其对动物疾病起有效的先天性免疫作用。NETs的纤维结构可以向炎症部位局部输送高浓度的抗菌因子，进而将结合的微生物隔离，杀灭病原体。NETs也可作为一种物理屏障，预防病原体进一步侵入[6]。研究发现，中性粒细胞可感应微生物大小并选择性释放NETs以抵抗大型病原体。这种选择依赖于吞噬和NETosis两个过程对中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)的竞争。当中性粒细胞遇到较大且无法被吞噬的微生物时，由于没有吞噬体，NE可以通过一种不涉及膜融合的替代途径缓慢释放到胞浆中。然后NE自由地转移到细胞核，并驱动染色质去致密化。这种简单而有效的机制允许吞噬细胞区分小病原体和大病原体[18]。中性粒细胞具有多样的抗菌方式，在抵御疾病时，可以选择实施有效的抗菌策略以清除病原体，NETs作为其中的一种途径，对维护机体健康有积极的影响。

NETs对真菌感染有抵御作用。研究发现在白色念珠菌感染后，中性粒细胞释放的NETs含有钙卫蛋白。动物试验已证明钙卫蛋白对小鼠局限性脓肿、肺念珠菌病和系统性白色念珠菌病的白色念珠菌生长都有抑制作用。白色念珠菌定殖的区域显示有网状结构覆盖真菌表面[19]。当白色念珠菌侵入机体时，与含钙卫蛋白的NETs相互作用，有助于抑制真菌感染。

NETs可以抵御细菌感染。Li等[20]研究报道,肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)可以催化组蛋白瓜氨酸化，从而诱导染色质去致密化，形成NETs。并通过菌落形成分析和小鼠试验表明，经PAD4介导形成的NETs对痢疾杆菌和化脓性链球菌均有杀菌作用。PMA刺激中性粒细胞生成NETs，通过过氧化物酶活性测定出形成的NETs中含有MPO，对感染的金黄色葡萄球菌有杀灭作用[21]。NETs在猪链球菌清除和炎症中也有重要作用，有助于防止猪链球菌感染。猪链球菌2型被认为是主要的猪病原体之一，对猪或与猪肉产品接触密切的人群存在健康威胁[22]。中性粒细胞是防御猪链球菌2型感染的第一道免疫防线，NETs可发挥其介导的杀伤作用抵抗猪链球菌2型侵入机体。Zhao等[23]采用了3种猪链球菌2型强菌株感染纯化的中性粒细胞，进行胞外核酸染料染色后，通过激光扫描显微镜观察到所有菌株都可以在早期诱导NETs的生成。

此外，王超群等[7]通过健康母猪外周血分离的多形核中性粒细胞进行试验，证明NETs的形成与孕酮诱导剂量以及孵育时间呈正相关。也有报道指出引起犬子宫蓄脓的细菌可以诱发NETs，但是NETs在该疾病中的利弊还未确定[24]。不可否认，NETs在先天性免疫过程中对抵御动物疾病有帮助。

4 NETs参与疾病过程损害机体

虽然对NETs参与疾病过程的细胞机制还有待研究，但是越来越多证据表明NETs除了捕捉和杀死病原体外，与许多疾病有相关性。

4.1 NETs诱发组织和细胞损伤 C型凝集素受体成员Dectin-1是主要的抗真菌吞噬受体之一，通过外周血中性粒细胞体外和体内试验发现，利用Dectin-1的吞噬作用作为微生物体积大小的传感器，可通过减少中性粒细胞蛋白向细胞核的移动来阻止NETs的释放。Dectin-1缺陷导致吞噬功能受到干扰后，中性粒细胞可能不加选择的释放NETs，导致组织损伤和宿主死亡[18]。

NETs组成成分具有的细胞毒分子和蛋白酶可能造成组织损伤。魏正凯[25]研究证实奶牛乳腺导管中，NETs的组蛋白成分可以通过激活Caspase-1、NLRP3和Caspase-3途径，诱导乳腺上皮细胞焦亡、凋亡和坏死，损伤乳腺组织(封二图2)。LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中，肺组织和支气管肺泡灌洗液中都检测到NETs存在。在通过NETs对上皮细胞和内皮细胞的直接作用研究中发现，NETs可诱导上皮细胞和内皮细胞的毒性作用。而将内皮细胞、肺上皮细胞与未消化或DNA消化的NETs共同孵育时发现，NETs所含的DNA成分不改变NETs介导的细胞毒性作用。Saffarzadeh等对NETs蛋白成分的研究表明，NETs的细胞毒性在很大程度上是由组蛋白介导的，MPO也在一定程度上介导NETs的细胞毒性。NETs介导细胞毒性这一特点表明其可能参与造成肺损伤[26]。

图2 NRTs对牛奶乳腺组织损伤作用[25]

肥胖与代谢综合征在伴侣动物中并不少见，其相关的血管异常表现之一是内皮功能障碍，而NETs积累可以对内皮功能造成影响。Gupta等[27]报道在体外条件下，毒胡萝卜内酯或肿瘤坏死因子α诱导的中性粒细胞和活化内皮细胞共同培养物中检测到NETs形成，长时间与NETs接触的内皮细胞死亡，此过程可能由内皮细胞激活产生的IL-8介导。这种损伤可以通过加入二苯碘酸抑制NETosis所需的NAPDHA氧化酶途径或DNase破坏NETs而消除。Wang等[28]采用喂食小鼠高脂肪食物，建立饮食性肥胖小鼠模型，发现与正常小鼠相比，模型小鼠中NETs形成标志物Cathelicidin相关抗菌肽显著增加；试验还显示，用DNase降解NETs或氯酰胺预防NETs形成可以恢复饮食性肥胖小鼠肠系膜动脉内皮依赖性血管舒张功能。这些发现都提示NETs在内皮功能障碍中起重要作用，并且这种作用对机体是不利的。

4.2 NETs促进凝血性疾病发生发展 NETs是获得性凝血病的关键激活因子。NETs的有效诱导因子之一是血小板，已有研究证明血小板-中性粒细胞促进NETosis的潜在机制[29]。当血小板、凝血因子和纤维网状结构上组蛋白和弹性蛋白酶接触后，血小板活化、聚集，纤维蛋白沉积引起血栓形成，从而阻塞微血管，导致灌注减少和器官损伤[30]。当血小板参与NETosis时，血小板和NETs之间相互作用对动物的炎症性疾病和血栓形成有促进作用，对机体健康造成损伤。

NETs与血栓形成有相关性。赵晶斌等[31]通过中外数据库检索了自2004年以来与NETs和静脉血栓栓塞症相关的研究报道，通过筛选和总结表明NETs参与了血栓形成的起始和生长阶段：内皮细胞的活化和Weibel-Palade小体的释放对血栓形成起始阶段起重要作用，而NETs诱导内皮损伤，促进血栓形成；同时，NETs可以作为血小板黏附聚集的支架；并且NETs组分中弹性蛋白可以使组织因子途径抑制剂水解而失活，促进外源性凝血过程。而组成成分中组蛋白、DNA与凝血因子之间的相互作用，使NETs参与内源性途径的凝血过程[31]。Brill等[32]在狒狒试验性下肢深静脉血栓中，检测到细胞外DNA在血浆中积累，在静脉血栓中存在DNA及组蛋白。进一步通过下腔静脉血流限制建立实验性深静脉血栓小鼠模型，通过免疫组化检测到血栓中存在NETs的成分，表明NETs促进了深静脉血栓的形成[32]。

4.3 NETs加重自身免疫性疾病 NETs参与自身免疫疾病过程。动脉粥样硬化发病的主要驱动力是巨噬细胞分泌的细胞因子白细胞介素1β(Interleukin-1beta，IL-1β)。Warnatsch等[1]应用小鼠动脉粥样硬化模型发现，胆固醇晶体既是IL-1β产生的启动信号，又是激活炎症小体加工IL-1β的危险信号。胆固醇晶体能触发中性粒细胞释放NETs，NETs启动巨噬细胞释放细胞因子，激活动脉粥样硬化斑块中扩增免疫细胞募集的辅助性T淋巴细胞17(Th17)。因此，危险信号如胆固醇晶体可通过与中性粒细胞的相互作用而产生NETs，驱动无菌性炎症。此外，未被降解的NETs激活补体可加重系统性红斑狼疮病情。研究发现，系统性红斑狼疮患者血清对NETs的降解能力降低，无法恢复NETs降解能力的病患病情相对更加严重，血液中补体蛋白C4和C3水平也较低。补体部分具有结合DNA潜力的蛋白与NETs相互作用，其中C1q结合良好，C3b沉积在NETs上。进一步研究发现，C1q抑制血清和纯化C1q与DNase-I组成的系统中NETs的降解，并且C1q在生理浓度下不抑制血清中NETs的降解。研究表明，NETs可以激活补体，进而诱导炎症和调节适应性免疫反应，从而产生NETs特异性抗体。NETs降解减少导致补体沉积和自身抗体沉积，招募更多补体，形成NETs降解减少和促炎反应的恶性循环[2]。

5 展望

NETs作为非特异性免疫的组成部分之一，是动物机体中不可或缺的一种抵抗病原入侵的途径。但是在某些情况下，NETs又参与疾病的发生发展，造成可能的组织损伤甚至危及动物生命。然而，NETs在动物疾病发生发展中的机制还有很广阔的研究空间和应用前景，NETs的有益作用以及有害作用之间的具体界限有待量化。鉴于NETs独特的双面性，怎样调控和量化NETs的形成，发挥其杀灭病原的积极作用，尽量预防其抑制机制失调或被过度激活带来的负面作用，对于疾病的防控具有重要的临床意义。

综上所述，通过调控NETs的形成和抑制可以为动物疾病的治疗提供新的靶向，但NETs相关疾病研究目前仍处于起步阶段，如何建立NETs靶向以达到防治疾病的目标还需要深入研究。本课题组前期研究已发现，NETs可调控mTOR通路、PI3K-ERK通路和肠细胞紧密连接通路等，参与由于硒缺乏、铝中毒以及镉暴露引起的组织和细胞损伤。但是，如何把这些分子机制应用到临床疾病的预防和治疗，还需要更深入的研究。