益气养阴散结方对A549裸鼠肿瘤生长、瘤内脂肪沉积及血清瘦素、脂联素的影响

杨雪飞,李 达,黄 挺,张志娣，叶知锋,刘 冰

(1浙江中医药大学附属杭州市中医院肿瘤科·浙江 杭州 310007;2浙江大学医学院附属邵逸夫医院·浙江 杭州 310007；3浙江省中医药研究院·浙江 杭州 310007)

益气养阴散结方系全国名老中医药专家传承工作室指导老师、浙江省级名中医、杭州市中医院张志娣主任中医师经验方，由黄芪、南北沙参、天麦冬、制首乌、枸杞、生牡蛎等组成，前期临床观察结果表明，本方联合EGFR-TKIs可延长生存期(中位OS)，提高疾病控制率，改善临床证候，提高生活质量[1]。此外，动物预实验结果表明，益气养阴散结方具有显著抑瘤效果。本研究在前期临床与实验基础上，采用BALB/c荷A549裸小鼠为研究对象，探讨益气养阴散结方对肿瘤生长、瘤内脂肪沉积及血清瘦素、脂联素的影响，为今后临床与实验研究提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物与细胞株 SPF级BALB/c雄性裸鼠30只，4～6周龄，体质量18～22 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。饲养于浙江中医药大学动物中心SPF级动物房，实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2015-0008，分笼饲养，相对湿度 40%～50%，室温 20～25℃。适应性饲养1周后用于实验。人肺腺癌A549细胞株购于中科院上海细胞所。

1.2 实验药物、试剂与仪器 益气养阴散结方药剂制备：依处方称取黄芪、南沙参、北沙参、天冬、麦冬、制首乌等9味药材，水煎2次，合并滤液，浓缩至生药浓度2 g/mL，备用。顺铂注射液：江苏豪森药业股份有限公司，国药准字：H20040813，批号：180804，规格：30 mg∶6mL。Mouse Leptin ELISA Kit、Mouse Adiponectin ELISA Kit：杭州联科生物技术股份有限公司；油红O染液：美国Sigma-Aldrich公司。BX43型显微镜：OLYMPUS公司；DW-86L388型超低温冰箱：青岛海尔集团；CM1860UV型冰冻切片机：德国LEICA公司；SpectraMax Plus 384型全波长酶标仪：美国MD公司。

2 方法

2.1 模型制备与分组给药 取BALB/c小鼠，常规皮下接种A549单细胞悬液以复制模型，随机分为5组，每组6只，即：模型组、顺铂组和益气养阴散结方低、中、高剂量组。 接种24 h 后，各组动物按如下剂量给予相应药物：模型组予等量生理盐水，顺铂组予顺铂4 mg/kg，益气养阴散结方低中高剂量组予5、10、20 g/kg益气养阴散结方。模型组及益气养阴散结方各组灌胃给药，每日1次；顺铂组腹腔注射给药，每周2次。连续给药8 周。

2.2 观察指标

2.2.1 肿瘤体积及肿瘤生长曲线 从用药第1天开始，隔日以游标卡尺测量肿瘤最长径(a)与垂直径(b)，计算肿瘤体积(V)，直至第8周观察结束。V=ab2/2，取各组平均值，绘制肿瘤生长曲线。

2.2.2 血清瘦素、脂联素含量测定 末次给药后12 h，眼眶取血，参照试剂盒说明书，采用酶联免疫吸附测定技术(ELISA法)检测血清瘦素、脂联素含量。

2.2.3 抑瘤率 末次给药后12 h,眼眶取血后处死动物，剥离肿瘤块，称重，按以下公式计算抑瘤率：抑瘤率=(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%

2.2.4 瘤内脂肪沉积观察 取瘤组织，制备冰冻切片，置于油红O染色剂中染色15 min；用60%乙醇分色，水洗；置于苏木素中染色30 s，用水冲洗至变蓝；甘油PBS封固，光镜下观察并摄片。

3 结果

3.1 成瘤及裸鼠一般情况 30只裸鼠均成瘤，成瘤率100 %，成瘤时间为细胞种植后第5～12天，集中于第9～11天。肿瘤细胞种植后第15天，平均肿瘤直径为3.7 mm。成瘤早期，裸鼠体质量及活动情况无明显改变，随着肿瘤形成、增大，裸鼠逐渐消瘦，活动量减少。各实验组之间裸鼠体质量无明显差异，实验前后裸鼠的体质量亦无明显差异。在实验期内，模型组与中药中剂量组各死亡1只裸鼠。

3.2 各组小鼠肿瘤体积变化 与模型组比较，顺铂组肿瘤体积在D22～D52显著减小，差异具有统计学意义(P<0.05)，D54时极显著减小，差异具有统计学意义(P<0.01)；中药低、中剂量组肿瘤体积差异无统计学意义(P>0.05)，中药高剂量组肿瘤体积在D24～D54显著减小，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中在D48、D50、D52时极显著减小，差异具有统计学意义(P<0.01)。各组小鼠肿瘤生长曲线见图1。

图1 各组小鼠肿瘤生长曲线

3.3 各组小鼠瘤重、抑瘤率比较 见表1。

表1 各组小鼠瘤重、抑瘤率比较

3.4 各组小鼠血清瘦素、脂联素含量与脂联素/瘦素比较 见表2。

表2 各组小鼠血清瘦素、脂联素含量与脂联素/瘦素比较

3.5 各组小鼠瘤内脂肪沉积比较 与模型组比较，顺铂组、中药低、中、高剂量组瘤内脂肪沉积均显著减少。见图2。

图2 各组小鼠瘤内脂肪沉积比较

4 讨论

肺癌属祖国医学“肺积”“喘咳”“肺胀”等范畴。本病总的病机为本虚标实，虚则气阴亏虚，实则痰湿、癌毒壅积肺脏；盖因烟气薰炙，或因久病致虚，耗散肺脏阴气，因虚致实；或因放化疗之邪毒侵袭，灼伤肺津，热伤肺络，痰浊阻于肺络；痰热内蕴日久，余热留恋，耗伤正气，久热伤阴。诸般证候纷至沓来， 终致气阴两虚而邪毒壅塞。肺为娇脏，喜润而恶燥，邪毒壅塞则愈发失于宣发肃降，从而加重咳喘、痰饮诸症[2-3]。

上世纪七十年代，杨少山名老中医创立“养肺阴益中气”为主的肺癌治疗法则。张志娣主任医师受业于杨老中医，张师根据多年侍诊心得，结合自身临床经验及非小细胞肺癌病因病机，拟定益气养阴散结方。方中黄芪补益脾肺之气，是为君药；南北沙参、天麦冬、制首乌、枸杞助君药滋阴润肺生津，俱为臣药；复以生牡蛎、浙贝化痰祛湿散结，桑白皮清热化痰，均系佐使。攻补兼施，抑邪扶正[1]。

前期临床观察结果表明，在EGFR突变的非小细胞肺癌中，益气养阴散结方联合EGFR-TKIs能延长EGFR-TKIs继发耐药的晚期非小细胞肺癌生存期；与化疗组(多西他赛/培美曲塞+顺铂/卡铂)及EGFR-TKIs组比较，疾病控制率显著提高，临床证候显著改善；与EGFR-TKIs组比较，生活质量显著提高。此外，动物实验结果表明，益气养阴散结方具有显著抑瘤效果[4]。

脂肪沉积、脂代谢异常与肿瘤发生及侵袭性成正相关性。脂肪促进肿瘤发生、发展、转移，并与其转归与预后关系密切。在肿瘤组织主导下，白色脂肪发生棕化，形成了与肿瘤生长相适应的微环境。即使在有氧条件下，肿瘤组织也展现出特有的代谢异常，如葡萄糖有氧酵解、氧化磷酸化减弱、脂肪酸从头合成、β-氧化反应活跃；籍此营造的乏氧微酸微环境，对恶性肿瘤发生发展至关重要。此外，脂肪沉积也为肿瘤细胞维持其高速增殖提供充足能量。作为重要的脂肪细胞因子，瘦素/脂联素与恶性肿瘤发生、发展成正相关/负相关关系，在肿瘤发病与治疗方面发挥重要作用[5-11]。本研究结果显示，益气养阴散结方可显著降低血清瘦素水平，显著提高血清脂联素水平，显著提高脂联素/瘦素比值。

综上所述，益气养阴散结方可显著抑制肿瘤生长，显著减少瘤内脂肪沉积，显著降低血清瘦素水平，显著提高血清脂联素水平，显著提高脂联素/瘦素比值，从而发挥抗癌作用。以上研究结果为本方进一步临床与实验研究提供了实验基础。