续仲接骨散的薄层色谱鉴别与含量测定

刘 彦，韩德强，付玮辰，梁丽丽

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

续仲接骨散由槲寄生、续断、当归、杜仲、制马钱子、冰片、大黄、全蝎等中药组成，具有活血化瘀、消肿止痛、接骨续筋之功效；用于跌打损伤、筋断骨折、瘀血肿痛等病症；是本院临床常用且疗效确切的经验方。原标准只有当归、杜仲、冰片的薄层色谱鉴别及士的宁的含量测定方法。本方属于按传统工艺配制的散剂，为了按要求对医疗机构传统工艺配制的中药制剂进行备案制管理，同时能够更加全面、科学、有效地控制其质量，课题组对续仲接骨散的原质量标准进行了进一步研究改进，在此基础上初步建立续断薄层色谱方法及制马钱子的两种成分含量测定方法。结果显示，本实验所确立的川续断皂苷Ⅵ的定性方法及士的宁、马钱子碱定量方法专属性好，简单并具有可重复性，便于更好地控制其质量。报道如下。

1 实验材料

1.1 试药 续仲接骨散(批号：210501、210502、210503)：黑龙江省中医药科学院制剂室提供。马钱子总生物碱对照提取物(批号：112030-201601)、川续断皂苷Ⅵ(批号：111685-201707)：中国食品药品检定研究院。庚烷磺酸钠为色谱纯：上海展云化工有限公司；乙腈为色谱纯(DIKMA)；其他试剂均为分析纯；水为重蒸水。

1.2 仪器 戴安P680高压液相色谱仪：美国戴安公司；BT25S型十万分之一电子天平、BSA224S型万分之一电子天平：德国赛多利斯；KQ-700VDB双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HHS-21-6电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

2 方法与结果

2.1 续断的TLC鉴别

称取本品散剂5 g，加入稀乙醇20 mL，超声处理30 min，提取液滤过，滤液于水浴锅上蒸至无醇味，加入水20 mL，混匀，以水饱和正丁醇50 mL振摇提取，正丁醇液用氨试液30 mL洗涤，弃去氨试液，正丁醇液再用水30 mL洗涤，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇l mL溶解，制成供试品溶液[1]952。另取川续断皂苷Ⅵ对照品，以甲醇溶解并制成每l mL含1 mg的对照品溶液。再称取处方比例的无续断样品按同一方法制成续断阴性液。照(通则0502)试验，将3 种溶液于硅胶G薄层板上点样，点样量均为5 μL，展开剂选取正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上层溶液，喷以10%硫酸乙醇溶液并立即加热至斑点显色清晰[1]952。结果可见：供试品色谱于日光下检验，可以清晰检出与川续断皂苷Ⅵ对照品相同颜色的斑点，阴性样品未检测到干扰斑点。见图1。

1～3.供试品；4.川续断皂苷Ⅵ；5.阴性供试品图1 续断薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP 80A(4.6 mm×250 mm，4 μm)；流动相：乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值至2.8)(21∶79)为流动相[1]53；检测波长260 nm[1]53；流速：1.0 mL/min.

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取马钱子总生物碱对照提取物18.70 mg于50 mL量瓶中，以甲醇超声数分钟溶解并定容至刻度，即得(每1 mL含士的宁0.18 663 mg、马钱子碱0.16 980 mg)。

2.2.3 供试品溶液制备 取本品散剂充分混匀，取5.5 g，精密称定，置磨口三角瓶中，加氢氧化钠试液6 mL，混匀后室温放置30 min，精密量取三氯甲烷40 mL加入后密塞，称定其重量，回流提取2 h，放冷，再称定重量，以三氯甲烷对减失的重量进行补足，摇匀，使三氯甲烷液通过无水硫酸钠的滤纸进行滤过，精密量取续滤液6 mL[1]53，60 ℃以下蒸干，立即冷却，残渣立即用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照品溶液制备 取按照本品散剂的处方组成及处方工艺制成的不含制马钱子阴性样品，同2.2.3所述方法制成制马钱子阴性对照溶液。

2.2.5 专属性 依次将上述阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液注入色谱仪测定其方法的专属性。结果表明：阴性色谱图在士的宁、马钱子碱对应保留时间位置上未检测到干扰吸收峰。见图2。

图2 续仲接骨散的HPLC色谱图(A.马钱子碱；B.士的宁)

2.2.6 线性关系考察 将2.2.2项下对照品溶液稀释制成如下浓度：士的宁对照品浓度为0.03 733、0.07 465、0.11 198、0.14 930、0.18 663 g/L、马钱子碱对照品溶液浓度为0.03 396、0.06 792、0.10 188、0.13 584、0.16 980 g/L，依次分别注入色谱仪，测得回归方程分别为Y=268.65X+0.0998(r=0.9997)、Y=226.6X+0.1500(r=0.9997)；结果士的宁、马钱子碱峰面积与进样量呈现良好的线性关系。

2.2.7 精密度 将对照品(士的宁：0.11 198 g/L、马钱子碱：0.10 188 g/L)溶液进样测定仪器精密度，进样量10 μL，由峰面积计算RSD分别为0.41%(n=6)、0.34%(n=6)。说明仪器具有较好的精密度。

2.2.8 稳定性 按照2.2.3所述方法，精密称取本品散剂制成供试品溶液，每隔一定时间进行样品稳定性的测定(0、4、8、12、16、24 h)，RSD分别为0.59%(n=6)、0.72%(n=6)。表示样品24 h内稳定。

2.2.9 重复性 取同批次本品散剂制成6份供试品，测定峰面积，计算士的宁、马钱子碱平均含量分别为0.8 803 mg g-1，RSD=0.48%(n=6)、0.5 998 mg g-1，RSD=0.76%(n=6)。结果显示此方法有良好的重复性。

2.2.10 回收率 取同批次散剂6份，每份约1.3 g，精密称定，精密加入对照品溶液，制备供试品溶液，计算士的宁、马钱子碱回收率，结果见表1。

表1 续仲接骨散中士的宁、马钱子碱的回收率试验(S.士的宁；M.马钱子碱)

2.2.11 含量测定结果 照上述建立的含量测定方法分别测定3批续仲接骨散(210501、210502、210503)士的宁、马钱子碱含量，经过计算，本品含士的宁分别为0.8 765、0.8 806、0.8 783 mg/g，含马钱子碱分别为0.6 027、0.5 986、0.6 009 mg/g，综合3个批次测定结果与考虑实际生产前处理粉碎与过筛收率、配研混合等各方面因素，暂定本品制马钱子以士的宁(C21H22N2O2)计，应为0.46～1.21 mg/g；以马钱子碱(C23H26N2O4)计，不得少于0.31 mg/g。

3 讨论

续断具有补肝肾、强筋骨、止崩漏的功效；近代药理学研究显示续断在治疗骨质疏松和骨伤愈合等方面有良好作用[2-3]。续断含三萜皂苷、生物碱、总黄酮、环烯醚萜苷等多种成分[2-3]，其中三萜皂苷类成分最为丰富。续断在本处方中占有重要地位，因此本实验对续断的活性成分川续断皂苷Ⅵ进行薄层色谱鉴别。川续断皂苷Ⅵ性质比较稳定，采用药典方法并在此基础上加以改进，实验对比了参考文献色谱条件中展开剂三氯甲烷∶甲醇(4∶1)[4]与本实验选取的正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)[1]952的上层溶液的条件，发现方法均可行，但本实验药典条件提取溶剂与展开剂种类的毒性均远远小于参考文献，所以选定药典展开剂为本实验色谱条件；由于此皂苷成分稳定性好且续断在本方中含量相对较高，因此该薄层色谱鉴别方法基本不受外界因素干扰，重复性和专属性均良好。

制马钱子具有散结消肿、通络止痛之功效，其有效活性成分主要为生物碱类，制马钱子为本方中君药，其代表性成分分别为士的宁与马钱子碱，其有效成分亦是其毒性成分，其中士的宁毒性较大，是马钱子碱毒性的20 倍[5]，但其疗效却为马钱子碱疗效的40 倍。原标准中只有针对士的宁一种成分进行含量测定的方法，为了进一步加强本方对于制马钱子的毒性生物碱类成分的合理性与安全性的有效控制，本实验采用马钱子总生物碱对照提取物为对照，利用2020版药典条件对2 种成分同时进行含量测定。实验过程中比较了原方法色谱条件流动相甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用10%磷酸调节pH值为2.5)(25∶75)、检测波长为254 nm，发现该色谱条件只有针对士的宁成分的理论塔板数超过了2 000，而且此条件下发现马钱子碱出峰时间落后于士的宁色谱峰保留时间，峰展宽程度较高，并且出现前沿峰，峰型对称性较差。而本实验选取的药典条件为离子对试剂庚烷磺酸钠与磷酸二氢钾，此条件两种成分色谱峰保留时间较为适宜，且无色谱峰展宽现象。本实验选取的药典条件检测波长260 nm的紫外吸收更强，检测灵敏度高于254 nm，提高了检测灵敏度，并且在一定程度上降低了基线噪音与检测误差。同时也比较了文献流动相乙腈-水-二乙胺(34∶100∶1)[5]，此条件对柱温条件要求严格，柱温对色谱峰保留时间影响波动比较大。虽然原标准与文献的色谱条件简单，价格相对低廉，但是达不到双成分含量测定分析方法的要求，本方法采用的离子对试剂即便对C18色谱柱寿命有影响，但综合考虑测定方法的准确性等因素仍选用药典条件为本实验的流动相。该条件下图谱杂质峰少，经方法学验证，专属性强，可以更加有效地控制本品的内在质量及服用剂量。