HPLC法同时测定三子颗粒中没食子酸、川楝素和栀子苷的含量

戴小燕，张 婷，严道荣

(1温州市中医院·浙江 温州 325000；2杭州奥默医药股份有限公司·浙江 杭州 311112；2浙江康恩贝中药有限公司·浙江 丽水 323400)

三子颗粒是由诃子、川楝子、栀子3味药组成的蒙药制剂，具有清热、凉血、解毒作用，用于治疗瘟热、眩晕、头痛、血热目赤等症。本品在部颁标准[1]中已收载，目前中国药典已经对川楝子饮片中的川楝素以及栀子饮片中的栀子苷等有效成分进行了质量控制，但部颁标准中并未对三子颗粒中相关有效成分的含量进行限定，而其散剂三子散药品也仅对栀子苷进行了检测[2]。虽然文献有对三子颗粒中的一味或两味药的活性成分含量研究的报道，但同时测定三子颗粒中3味药物多个化学成分含量却很少有相关报道。本文采用高效液相色谱法(HPLC)同时测定三子颗粒诃子中的活性成分没食子酸、川楝子中的活性成分川楝素以及栀子中的活性成分栀子苷的含量，进行方法学考察，为有效控制该制剂的质量标准提供科学的参考依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪：安捷伦公司；十万分之一电子天平：METTLER TOLEDO瑞士梅特勒-托利多公司；KQ5200超声波清洗器：昆山市超声波仪器有限公司。

三子颗粒：内蒙古凯蒙药业有限公司，批号：18010301、19050901、19091203。没食子酸、川楝素、栀子苷的对照品：中国食品药品检定研究院，批号分别为：110831-201906、111842-201001、110749-201919。水为高纯水；乙腈、三氟乙酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取没食子酸对照品49.68 mg置50 mL量瓶中、川楝素对照品12.51 mg置50 mL量瓶中、栀子苷对照品63.12 mg置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解，定容至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。再精密吸取以上对照品储备溶液按照3∶2∶5的比例混合，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液的制备 取本品10袋(批号：18010301)，混合，研细，取细粉约0.32 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性品溶液的制备 甲醇为空白溶液。

2.4 色谱条件 采用Chanin HPU-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以流动相A(乙腈)和流动相B(0.1%三氟乙酸溶液)进行梯度洗脱(0～60 min，5%→60%A)，流速为1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长为230 nm，进样量为20 μL，理论板数(n)按没食子酸、川楝素和栀子苷计算均在4 000以上，分离度均大于1.5。对照品、样品、阴性溶液色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

2.5 线性关系考察 分别精密量取2.1中浓度为993.5 mg·L-1的没食子酸对照品溶液、125.1 mg·L-1的川楝素对照品溶液和631.2 mg·L-1的栀子苷对照品溶液适量，加甲醇配成浓度为3.97、39.74、99.38、198.75、317.92、397.40 mg·L-1系列没食子酸对照品溶液，0.42、0.83、1.67、4.17、6.67、8.34 mg·L-1系列川楝素对照品溶液和3.79、37.87、94.68、189.36、302.98、378.72 mg·L-1系列栀子苷对照品溶液，按2.4中的色谱条件测定峰面积，并且以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，计算回归方程和相关系数，得到线性方程：Y=11.708X-6.2641，r2=0.9999；Y=1.0629X+0.0034，r2=0.9998;Y=8.453X+9.1751，r2=0.9998;结果表明没食子酸在3.97～397.40 mg·L-1，川楝素在0.42～8.34 mg·L-1，栀子苷在3.79～378.72 mg·L-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.6 稳定性实验 取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按照2.4中的色谱条件进行测定，分别计算供试品溶液没食子酸、川楝素和栀子苷的峰面积RSD。得没食子酸、川楝素和栀子苷峰面积的RSD分别为0.5%，1.7%和1.3%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7 精密度试验 分别精密吸取2.5中没食子酸浓度为317.92 mg·L-1、川楝素浓度为6.67 mg·L-1、栀子苷浓度为302.98 mg·L-1的对照品溶液，按2.4中的色谱条件，重复进样6次，记录其峰面积，计算其RSD。得到没食子酸、川楝素和栀子苷峰面积的RSD分别为0.4%，1.6%，0.9%(n=6)；结果表明该条件下仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 称取同一批次(批号：18010301)的三子颗粒，按2.2项下的方法平行制备6份供试液并依法测定。结果显示没食子酸、川楝素和栀子苷含量的RSD分别为1.7%，1.2%，1.8%(n=6)；表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取已知含量的三子颗粒(含没食子酸2.483%、川楝素0.050%、栀子苷2.227%)样品粉末适量，计9份，每份约0.16 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液适量，挥干溶剂，精密加甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，按2.4项下的色谱条件进样测定，计算回收率及RSD。结果见表1。

表1 没食子酸、川楝素和栀子苷的含量加样回收率测定结果(n=9)

续表1 没食子酸、川楝素和栀子苷的含量加样回收率测定结果(n=9)

2.10 样品含量测定 按照2.2项下的供试品制备方法和2.4项下的色谱条件对3批样品(批号：18010301、19050901、19091203)中没食子酸、川楝素和栀子苷进行测定，记录其峰面积，计算其含量。结果见表2。

表2 3 批样品中各成分含量测定结果

3 讨论

三子颗粒是由诃子、川楝子、栀子组成，是一种常用的蒙药。诃子能涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽，用于久泻久痢，便血脱肛，肺虚喘咳，久嗽不止，咽痛音哑；川楝子则味苦性寒，行气止痛、驱虫，用于肝郁化火，胸胁、脘腹胀痛，疝气疼痛，虫积腹痛；栀子清热利湿、泻火除烦、凉血解毒，用于热病心烦，淋证涩痛，湿热黄疸，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡，外治扭挫伤痛[2]。文献报道诃子、川楝子及栀子的有效成分具有抗炎、解毒、改善免疫功能等作用，从而起到清肺胃热、消炎解毒的作用，临床多应用于酒糟鼻[3]、婴幼儿湿疹[4]、高血压[5]、高脂血症的治疗[6]。

没食子酸是诃子中的主要药效成分，药理研究表明其具有抗氧化作用[7]。川楝素则是川楝子的主要活性成分，具有抗肿瘤活性、抑制脂肪形成活性、杀虫、拒食性等作用，但也具有一定的毒性，通常用它作为衡量川楝子药材质量的参考指标[8]。栀子苷作为栀子的主要活性成分，具有保肝利胆、降糖、神经保护、抗炎、抗血栓等作用[9]。目前关于三子散的质量控制已有相关文献报道[2,10-14]，尚无用HPLC法对没食子酸、川楝素和栀子苷的含量同时进行测定的报道。本实验采用高效液相色谱法同时测定没食子酸、川楝素和栀子苷3 种成分的含量，对三子颗粒的质量控制具有重要的参考意义。

本文在方法开发时对不同品牌和型号的色谱柱进行了筛选，最终采用的色谱柱为Chanin HPU-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)。在流动相条件的考察中，参考了三子散中的含量测定方法[2]，但没食子酸峰形不佳，后加入三氟乙酸，峰形得到改善，经过研究，最终采用通过乙睛-0.1%三氟乙酸溶液进行梯度洗脱的方法。

HPLC法进行多成分检测时，波长的选择是其中的关键因素。本文通过DAD对3 种成分进行全波长扫描，结果表明没食子酸的最大吸收波长为216 nm，川楝素的最大吸收波长为210 nm和栀子苷的最大吸收波长为242 nm，为了兼顾3 种成分同时测定的需求，故选择230 nm作为三者的检测波长。

本实验采用的HPLC法同时测定三子颗粒中没食子酸、川楝素和栀子苷的含量测定方法可行，该方法操作简便，精密度高，重现性好，样品回收率好，一测多评，能较全面地反映该制剂的质量，为该制剂的质量控制提供依据。