不同腧穴电针对多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜AR和ER蛋白表达的影响

徐 鸽，赵雪丹，陈跃来

(1上海中医药大学·上海 201210；2上海中医药大学附属龙华医院·上海 200032)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女常见的生殖内分泌代谢性疾病，主要表现为排卵障碍和高雄激素血症，患病率占育龄妇女的5%～10%[1]，约占不排卵妇女的75%[2]，是引起无排卵性不孕的主要原因。PCOS患者不孕的原因主要是不排卵和卵母细胞质量差等。PCOS患者经过不同方案治疗纠正内分泌代谢紊乱、促排卵后，虽然可以获得较高的排卵率，但早期流产率高达50%，最终妊娠率只有40%～50%[2]。妊娠失败与胚胎种植失败密切相关，而胚胎种植失败的主要原因在于不良的子宫内膜容受性。PCOS 患者机体复杂的内分泌和代谢的异常可影响子宫内膜容受性，克罗米芬促排卵治疗使内膜的异常发育进一步加重和容受性标志分子的异常表达[3]，是 PCOS患者生殖功能低下和不良妊娠结局发生率高的重要原因。

本课题组前期研究发现电针关元、三阴交、足三里可改善PCOS大鼠高雄激素血症，并能调节卵巢雄激素受体的表达，改善卵泡发育[4-5]。本次研究在前期研究基础上，观察PCOS大鼠子宫内膜的病理变化以及不同穴位电针对PCOS大鼠子宫内膜性激素受体表达的影响，探讨PCOS子宫内膜病变及针刺对其影响的机制和穴位特异性，以期为临床治疗提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 动物 健康清洁级6周龄雌性SD大鼠60只，体质量(160±20)g，购自上海市斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002。环境湿度40%～60%,温度20～23 ℃,每日光照12 h,自由饮水,喂饲标准大鼠颗粒饲料。实验方案经过上海中医药大学动物伦理委员会的审批，符合动物实验伦理审查规范(伦理编号：PZSHUTCM190308006)。

1.2 主要试剂与仪器 来曲唑片：江苏恒瑞医药股份有限公司；羧甲基纤维素(CMC)：国药集团化学试剂有限公司；雄激素受体(AR)抗体、雌激素受体(ER)抗体：武汉赛维尔生物科技有限公司。华佗牌SDZ-V型电针治疗仪：苏州医疗用品厂有限公司；华佗牌0.25 mm×25 mm一次性使用无菌针灸针：苏州医疗用品厂有限公司。DM 2000型显微镜：德国莱卡公司；Eclipse Ti-SR正置荧光显微镜：日本尼康公司；Image-pro plus 6.0图像分析软件：Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA。

1.3 动物分组、模型制备及处理 60只SD大鼠按随机数字表分为正常对照组、模型组、“三阴交”组、“足三里”组、“关元”组、综合组，每组10只。根据Kafali方法[6]，来曲唑溶于1% 羧甲基纤维素(CMC)中，除正常对照组外，其余5组大鼠按照1 mg/(kg·d)剂量灌胃给药，连续定时灌服21 d，正常饲养。灌胃第12天进行阴道涂片观察大鼠动情周期变化判定造模是否成功，大鼠阴道细胞涂片失去周期性变化为造模成功。正常对照组给予同浓度(0.1 mg/mL)同灌胃体积(10 mL/kg)的CMC溶剂灌胃，连续21 d，然后每日用大鼠固定器固定，连续14 d，不做针刺处理。模型组于造模成功次日开始，每日大鼠固定器固定，连续14 d，不做针刺处理。各电针组于造模成功次日开始，分别选择相应穴位进行干预。取穴方法及大鼠穴位定位方法参照《实验针灸学》[7]。各组大鼠固定器固定，分别取穴“关元”及旁开5 mm非穴位点，足三里组取双侧“足三里”，三阴交组取双侧“三阴交”，综合组3穴同时针刺，0.25 mm×25 mm 毫针针刺后接电针，两组电极分别连接刺入双侧“足三里”和双侧“三阴交”的毫针，另一组电极连接刺入“关元”及穴旁非穴位点的毫针；采用连续波，频率2 Hz，输出强度1～3 mA，大鼠肢体轻微抖动为度, 20 min/次,每日1次,连续14 d。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 标本采集 选择处于动情间期的大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射(0.1 mL/100 g)麻醉，剪开腹腔，迅速摘除双侧子宫于4%多聚甲醛溶液固定24 h，以备组织学观察。

1.4.2 子宫指数 取大鼠双侧子宫，剥离周围脂肪组织并称重，计算子宫指数。

1.4.3 卵巢、子宫病理学观察 取大鼠左侧卵巢、子宫，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片，脱蜡、水化后，苏木素染色，1%盐酸酒精分化，1%伊红溶液染色，脱水、透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.4.4 免疫组化法测定AR、ER表达 石蜡切片常规脱蜡至水，将组织切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复，自然冷却后PBS(pH 7.4)洗涤3次，然后将切片放入3%过氧化氢溶液(双氧水/纯水=1/9)，室温避光孵育25 min，以阻断内源性过氧化物酶：PBS洗涤3次，切片稍甩干后滴加3% BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min。轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加BSA按一定比例(AR抗体1∶500,ER抗体为1∶100)配好的一抗，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。第2 天PBS洗涤3次，滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50 min。PBS洗涤3次，滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染3 min，蓝化，脱水透明，中性树胶封片，并用PBS作阴性对照。

结果判定与分析方法：细胞质中见棕黄色或棕褐色颗粒细胞为阳性表达，每张切片随机选择观察视野5 个，采用Motic Images Plus 6.0 分析累计光密度 (IOD) 及染色区域的面积(Area)。平均光密度(AOD)=IOD/Area。

2 结果

2.1 造模及处理情况 瑞氏染色显示造模结束后造模各组大鼠每天阴道涂片镜下仅见大量白细胞，持续处于动情间期，全部失去规律动情周期，提示造模成功。正常对照组大鼠均有规律动情周期。结束治疗后第2 天动情周期处于间期大鼠，即刻处理；其余大鼠恢复喂食，至晚8点继续禁食过夜，治疗后第3 天涂片显示大鼠均处于动情间期，按前述标本采集方法处理。

2.2 各组大鼠子宫指数比较 见表1。

表1 各组大鼠子宫指数比较

2.3 各组大鼠卵巢与子宫病理学观察结果 正常对照组大鼠卵巢色泽红润，颗粒均匀，无囊状突起；光镜下检查可见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，颗粒细胞呈多层排列，形态完整。模型组大鼠卵巢肉眼观察颜色较为苍白、包膜增厚，可见囊状卵泡突起；光镜下可见囊状扩张卵泡，囊状卵泡内卵母细胞或放射冠消失，间质细胞增生，卵巢颗粒细胞层数减少，排列松散，可见较多发育早期的小卵泡，黄体少见。模型组卵巢形态学变化符合PCOS病理变化特征。各针刺组与模型组比较卵巢体积减小，囊状卵泡数量减少，黄体增加，卵泡的颗粒细胞层增加，并观察到带有卵丘的亚成熟卵泡。见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织病理学变化(HE，×40)

正常对照组大鼠子宫镜下可见内膜腺体数目较多，腺体多呈簇状排列，纡曲较多。PCOS 组大鼠肉眼观察子宫较正常组明显变细，光镜下观察子宫内膜变薄，内膜腺体数目与正常组相比明显减少，腺体多为单个分散排列，少有纡曲。而各电针组与模型组相比肉眼观察子宫直径增大，光镜下检查可见子宫内膜增厚，子宫内膜腺体增多，腺腔管壁增厚。三阴交组与关元组腺体较多，与正常组形态较为接近。见图2。

图2 各组大鼠子宫内膜组织病理学变化(HE，×100)

2.4 各组大鼠子宫AR、ER表达的免疫组化测定结果 AR在大鼠子宫的表达主要定位在子宫上皮细胞和间质细胞，阳性细胞大部分表现为棕褐色。 与正常对照组比较，模型组大鼠子宫内膜AR表达明显增加(P<0.05)；足三里组较模型组AR表达明显减少(P<0.05)，其余各电针组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。ER主要表达在大鼠子宫腺上皮和腔上皮细胞，间质细胞也有少量表达。模型组与正常组比较ER表达明显增加(P<0.05)，与模型组比较，足三里与三阴交组ER表达明显降低(P<0.01)，关元组和综合组有下降趋势但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图4。

表2 各组大鼠子宫内膜 AR、ER 蛋白表达比较

图3 各组大鼠子宫内膜AR表达(免疫组化，×100，标尺示100 μm，箭头示阳性细胞)

图4 各组大鼠子宫内膜ER表达(免疫组化，×100，标尺示100 μm，箭头示阳性细胞)

3 讨论

针灸治疗女性不孕症历史悠久，目前针刺治疗PCOS已开展了较多的临床研究，发现针刺可调节患者月经周期和激素水平，控制体重，改善反映胰岛素敏感性的指标如空腹血糖、空腹胰岛素等[8]；而且针刺能够改善PCOS患者卵子质量，提高体外受精-胚胎移植的临床妊娠率[9]。实验研究发现在影响子宫内膜容受性方面，针灸可通过提高胞饮突表达、增加薄型子宫内膜厚度等指标改善子宫内膜形态，并可影响子宫内膜微循环指标和整合素、同源框基因10等分子生物学调控因子的表达，从而影响子宫内膜容受性为胚胎着床提供良好条件，提高妊娠率，尤其是在辅助生殖领域应用具有显著优势[10]。

高雄激素是PCOS基本的最主要的病理特征，在PCOS发病中占重要地位，是本病主要的内分泌改变和导致PCOS临床症状的主要原因。雄激素通过与AR结合而发挥作用，雄激素作用的发挥与AR的分布和数量等密切相关。雄激素不仅作为底物生成雌激素，而且还在围种植期与雌激素相互作用调节子宫内膜生长。雄激素受体在子宫内膜的间质细胞和上皮细胞均有表达，呈周期性变化。在增殖期表达逐渐上升，于增殖晚期达到高峰；至分泌期雄激素受体在两种细胞上的表达均下降。ER是雌孕激素作用于子宫内膜容受性的中介。ER有α、β两种亚型，其中ERα表达于子宫内膜腺上皮和腔上皮细胞，间质细胞也有少量表达，是雌激素作用于子宫内膜的主要亚型。其含量与雄激素受体一样也呈周期性变化，增生期含量最高，于分泌期开始下降，并随着分泌期的进展逐渐减少，在分泌晚期的含量最少，此时最适宜胚胎着床。低雌激素水平可使子宫窗口期时相延长,高水平则使其很快关闭, ERα的降低被认为是内膜种植窗的标志。雄、雌激素及其受体在时间和空间上的正确表达是形成良好内膜容受性的重要因素，其中任一因素表达失常都可导致着床失败。研究发现，在PCOS患者子宫内膜上皮细胞中，雄激素受体在mRNA和蛋白水平的表达均明显上升，在种植期上升尤为显著[11]。无排卵的PCOS患者体内长期处于无孕激素拮抗状态，表达增加的雄激素受体与升高的雄激素协同作用，放大雄激素对子宫内膜的影响，进一步降低子宫内膜容受性[12]。有学者发现未治疗的PCOS 患者分泌中期子宫内膜 ERα表达明显高于正常对照组，ER 这种异常的表达可能与PCOS体内高雌激素刺激子宫内膜 ERα表达增多有关[13]。

本研究中发现PCOS大鼠子宫明显变细，子宫指数降低，子宫内膜变薄，腺体减少。子宫内膜AR、ER各组间比较，模型组显著高于正常组(P<0.01)，说明PCOS大鼠子宫内膜组织形态及性激素受体表达存在异常，可能与高雄激素内环境的刺激有关。 各针刺组子宫内膜增厚，形态改善。关元组子宫指数明显增加，其余3 组与模型组比较子宫指数差异无统计学意义，不同穴位干预效果存在差异。针刺足三里组大鼠AR和ER表达均显著低于模型组，针刺三阴交组ER表达显著低于模型组，但AR表达水平较模型组无显著差异，其余两针刺组与模型组比较AR、ER表达水平差异无统计学意义。说明针刺对PCOS大鼠异常的性激素受体表达有一定改善作用。课题组前期研究发现，针刺对雄激素水平和卵泡发育的调节作用以关元组效果较好[4-5]，本研究中关元组大鼠子宫指数较模型组增加明显，形态改善最佳，但对性激素受体的调节作用并不明显，针刺关元可能通过影响子宫内膜容受性其他调控因子或途径起效。电针不同穴位对子宫内膜容受性的干预机制存在差异，多穴位联合应用对PCOS大鼠子宫内膜的改善效应并未呈现作用叠加结果。提示临床治疗PCOS选穴应根据个体症状精简精准，盲目累加并不可取。