玉朗伞查尔酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠NF-κB信号通路的影响

梁杏梅刘喜华#黄建春陈春霞陈兆霓黄仁彬*

(1.广西卫生职业技术学院,药学系, 南宁 530023;2.广西医科大学,药学院, 南宁 530021;3.广西壮族自治区人民医院,科研部, 南宁 530021)

缺血性心脏病的本质是冠状动脉血流供应与心肌需求之间的失衡,是一种以缺血性损伤为主要特征的疾病,临床上以胸闷痹痛、心悸气短为主要症状,更有甚者会发展为心肌梗死[1]。缺血的心肌组织会伴随有心功能降低、心肌细胞缺氧、心肌代谢过程紊乱、有害物质聚集、诱发炎症反应并使得炎症因子过度释放等病理生理现象,因此,迅速恢复血液灌注是心肌缺血的基础防治措施[2]。但不少研究证实了立即恢复正常供血,则缺血状态得以扭转但心肌功能及组织结构已被严重破坏,更有甚者出现细胞凋亡和坏死,这种适得其反的现象即称为心肌缺血再灌注损伤[3]。

当前,国内外针对MI/RI进行干预的方法主要有缺血预适应、药物预适应、药物后处理、抵抗自由基损伤、减轻钙超载、减轻炎症反应等。其中药物干预通常选用抗血小板聚集、改善心肌细胞能量代谢、阻断钙离子通道的制剂等,虽产生一定作用,但其存在的针对性弱、疗效低下、耐受性差等不足也使得其应用受到了限制。另外,对于减轻炎症反应和减少炎症因子释放这条干预途径的研究也不在少数,尤其是对炎症通路NIK/IκK/IκB/NF-κB的研究也取得了不少进展[4],众多研究显示了对该通路进行适当干预之后,能抑制下游核因子NF-κB的活性表达,使得炎性反应得以改善、炎症因子的过度释放得以缓解,最终阻断了心肌炎症所介导的后续损伤,达到保护MI/RI的治疗效果。

玉郎伞(YLS,Millettiapulchra(Benth.)Kurz var.Laxior(Dunn)Z.Wei(Papilionaceae))原植物经考证为蝶形花科植物疏叶崖豆的块根,主产地为广西、福建、云南等,也是广西民间常用的壮药,在《广西中药材标准》《广西壮族自治区壮药质量标准(第一卷)》中有收载,常用于保护心脑血管、预防老年痴呆、调节血糖水平及保肝护肝等[5]。本研究小组从玉朗伞总黄酮中分离出了玉朗伞查尔酮单体成分(YLSC,17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮),见图1。在前期研究中,本小组发现YLSC在减轻心肌缺血、抑制氧自由基生成、减少心肌细胞凋亡、阻断心肌细胞钙离子通道、减轻钙超载、保护离体心肌细胞缺氧/复氧损伤等方面具有显著的保护作用[6-8],但YLSC对MI/RI保护的相关机制尚未明了,因此,本研究将对此进行探究,明确YLSC的保护机制是否与炎症通路NIK/IκK/IκB/NF-κB有关,实验结果可为YLSC防治MI/RI找寻新的作用靶点和治疗方案,具有较强的现实意义和应用前景。

图1 17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮的化学结构Figure 1 Chemical structure of 17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofura chalcone

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠60只,体重(265±15)g,雌雄各半,由广西医科大学实验动物中心提供[SCXK桂2020-0003],动物饲养在广西医科大学实验动物中心[SYXK桂2020-0004],室温控制在21℃～22℃,相对湿度控制在40%～70%,循环光照,饮水饮食自由取用。本研究通过广西医科大学动物实验伦理委员会的审批(201808009),按实验动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀,切实遵循和保障实验动物伦理。

1.2 主要试剂与仪器

1.3 实验方法

1.3.1 MI/RI模型的制备

SD大鼠随机分为6组(n=10):假手术组(sham group,给予蒸馏水2 mL/kg)、模型组(model group,给予蒸馏水2 mL/kg)、阳性对照组(PDTC group,给予PDTC 30 mg/kg)、YLSCH组(5.00 mg/kg)、YLSCM组(2.50 mg/kg)、YLSCL组(1.25 mg/kg)。各组大鼠经鼠尾静脉连续给与相应药物7 d,每天1次,于末次给药后除假手术组外均制备MI/RI模型,即结扎大鼠冠状动脉左前降支30 min后,再灌注60 min。

各组大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1.5 mL/kg),取仰卧位固定。气管倒T型切开后,连接到动物呼吸机(相关参数设置如下,respiratory rate:60～70 times/min,tidal volume:50 mL/kg,inspiration and expiration ratio:1∶2)。左侧胸腔消毒后逐层打开,扩张第3与第4肋间隙,在泪囊掀开器的助力下让心脏充分暴露于视野中,切开心包轻轻挤压胸廓使心脏挤出,可见冠脉左前降支起始部位藏于左心耳下缘与肺动脉圆锥左缘间,用6/0无损伤缝合线绕过平冠脉左前降支起始部位下缘约2 mm处(进针深度约1 mm,宽度约1～2 mm),连同空心硅胶管一并结扎。假手术组大鼠仅做穿线处理,不予结扎。待心肌缺血30 min后可将空心硅胶管剪开,即可解除结扎并恢复灌流状态,继续观察1 h。

1.3.2 心肌梗死面积的测定

再灌注1 h后,各组大鼠由左心室导管逆行注入1.5 mL伊文思蓝(浓度为5%),在心肌正常组织被充分染色后,剪下心脏平行于左心室长轴制作厚度为1～2 mm的薄片[9]。将心室薄片放入1% TTC磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中水浴15 min,由于受损心肌的细胞膜损伤导致细胞中的脱氢酶释放漏出而丢失,故梗死心肌组织不被染色。心室薄片的染色结果使用Image J图像分析软件进行分析统计。白色即未被染色的部分为梗死心肌,染成蓝色的部分为残存的正常心肌组织,染成红色的部分为缺血心肌组织。红色的缺血组织与白色的梗死组织一并称为缺血区(area at risk,AAR),其中白色的梗死组织又称为梗死区(area of necrosis,AN)。计算公式:缺血范围=AAR/心室横截面积,梗死范围=AN/AAR。

1.3.3 血清中CK、CK-MB及 Hyp水平的测定

再灌注60 min后,各组大鼠腹主动脉真空采血约5 mL,静置2 h后行高速冷冻离心(参数设置为:转速4000 r/min,离心时长10 min,离心温度4℃),取上层血清于-20℃环境下冻存。按说明书标准操作步骤分别测定血清CK、CK-MB及 Hyp水平。

1.3.4 免疫组化法测定NIK/IκK/IκB/NF-κB通路蛋白

水处理综合实验是上海理工大学环境工程专业本科课程,是获得学士学位的必修课。其先修课程是环境工程原理和水污染控制工程。课程每学年开设一次,安排在第5个短学期。在2014年下半学期之前,水处理综合实验基本采用演示性(“传统”)实验,即提供实验理论和程序的讲义给学生;实验小组进行实验,每人根据每次实验的结果,单独写一份实验报告并提交。整个学期至少进行5次实验。传统实验主要集中在水污染控制工程为基础的各处理单元(例如,混凝/絮凝、沉淀、吸附、氧化、生物处理)。通常第一次课安排的是实验室安全讨论课,而且在学期内有专业认识实习,安排两次污水处理厂的现场考察。

再灌注结束后,取各组大鼠缺血心肌组织制作切片,切片经二甲苯、无水乙醇、水进行梯度脱蜡,行抗原修复、3%过氧化氢甲醇液阻断内源性过氧化物酶的活性、PBS冲洗、血清封闭、添加抗体等操作进行封片。电子显微镜下观察切片,被染成棕黄色至深褐色的细胞核与细胞浆即为阳性蛋白。每只动物取3张切片,每张切片随机选取5个视野,对阳性着色区域进行观察分析,切片经Leica Qwin图象分析软件对大鼠心肌组织切片中NIK、IκK、IκB以及NF-κB的蛋白阳性表达情况进行半定量统计,结果以灰度值表示,数值范围在0～255之间,灰度值越低,则蛋白的阳性表达越高[10]。

1.3.5 Western blot法 测 定NIK/IκK/IκB/NF-κB通路蛋白

再灌注结束后,取各组大鼠约80 mg缺血心肌组织加入蛋白裂解液,制作组织匀浆并测定蛋白含量。蛋白经过上样、电泳、分离、PVDF(聚偏氟乙烯,Polyvinylidene Fluoride)膜转移后,将PVDF膜依次转入一抗(NIK、IκK、IκB、NF-κB)工作液及二抗工作液中进行孵育。将PVDF膜放入显色液中显色,观察显色反应过程,行漂洗、拍照,用Image J软件分析各条带的蛋白表达,相关数值用光密度(optical density,OD)值表示,计算公式为,目的蛋白的相对表达含量=目的蛋白OD值/内参(β-actin)OD值,比值越高,则提示目的蛋白的表达越高。

1.4 统计学方法

数据使用SPSS 13.0统计软件进行分析,免疫组化及Western blot图像半定量数据使用Leica Qwin图象分析软件及Image J软件进行分析,计量资料以平均数±标准差(±s)表示,组间比较采用ANOVA单因素方差分析,当P＜0.05时则表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YLSC对MI/RI大鼠心梗面积的影响

未观察到假手术组有梗死心肌,可观察到有略微的缺血组织,可能与打开大鼠胸腔且缝合针和缝合线绕过冠脉左前降支造成轻微缺血有关。与模型组比较,各组心肌组织缺血程度基本一致,差异无统计学意义(P＞0.05),提示结扎冠脉左前降支的手术操作平行性较好。与空白组比较,模型组与各给药组大鼠的心肌缺血范围扩大较明显(P＜0.05),提示缺血模型制备成功。与模型组比较,阳性对照组、YLSCH组和YLSCM组大鼠心肌梗死面积呈不同程度的减少(P＜0.01),YLSCL组大鼠心梗面积减少不明显(P＞0.05),提示YLSC能显著缩小MI/RI大鼠的心肌梗死范围。结果见表1和图2。

图2 YLSC对MI/RI大鼠心肌缺血范围和梗死范围的影响Figure 2 Effect of YLSC on myocardial risk area and infarction area in MI/RI rat

表1 YLSC对MI/RI大鼠心肌缺血范围和梗死范围的影响(±s)Table 1 Effect of YLSC on myocardial risk area and infarction area in MI/RI rat

表1 YLSC对MI/RI大鼠心肌缺血范围和梗死范围的影响(±s)Table 1 Effect of YLSC on myocardial risk area and infarction area in MI/RI rat

注:与假手术组比较, *P＜0.05;与模型组比较, ##P＜0.01。Note. Compared with the sham group, *P＜0.05. Compared with the model group, ##P＜0.01.

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2.2 YLSC对MI/RI大鼠血清CK、CK-MB及Hyp水平的影响

与假手术组比较,模型组及各给药组中的CK、CK-MB及Hyp水平显著增高(P＜0.05),心肌酶活性增强、心肌胶原组织破坏,提示模型制备成功;与模型组比较,YLSC可以降低MI/RI所致的CK、CKMB及Hyp水平的升高(P＜0.05或P＜0.01),且呈剂量依赖关系;YLSCL组大鼠的Hyp水平下降不明显,差距无统计学意义(P＞0.05)。提示YLSC对MI/RI大鼠心肌组织具有保护作用,能减少心肌胶原组织的破坏,减少心肌细胞损伤时心肌标志物CK和CK-MB的渗出。结果见表2。

表2 YLSC对MI/RI大鼠血清CK、CK-MB及Hyp水平的影响(±s)Table 2 Effect of YLSC on level of CK, CK-MB and Hyp in MI/RI rat

表2 YLSC对MI/RI大鼠血清CK、CK-MB及Hyp水平的影响(±s)Table 2 Effect of YLSC on level of CK, CK-MB and Hyp in MI/RI rat

注:与假手术组比较, *P＜0.05;与模型组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the sham group, *P＜0.05. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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2.3 免疫组化法测定NIK/IκK/IκB/NF-κB通路蛋白

由免疫组化结果可知,被染为黄色及棕黄色的细胞浆及细胞核为NIK、IκK、IκB及NF-κB蛋白的阳性表达。与假手术组比较,模型组和各给药组的IκB蛋白的阳性表达范围明显减少,而NIK、IκK及NF-κB阳性表达范围则明显增多。与模型组相比,YLSC能下调NIK、IκK及NF-κB的酶活性,抑制其蛋白表达的升高,同时减少IκB的降解,且呈剂量依赖关系(P＜0.05或P＜0.01)。说明YLSC对MI/RI大鼠具有保护作用,能减少NIK、IκK及NF-κB蛋白的表达,降低NIK和IκK的酶活性,能减慢IκB的降解并使其表达增多。结果见表3和图3。

图3 YLSC对MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影响Figure 3 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat

表3 YLSC对MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影响(±s,灰度值)Table 3 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat(gray value)

表3 YLSC对MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影响(±s,灰度值)Table 3 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat(gray value)

注:与假手术组比较, *P＜0.05;与模型组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the sham group, *P＜0.05. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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2.4 Western blot法测定NIK/IκK/IκB/NF-κB通路蛋白

实验结果显示,与假手术组相比,各实验组NIK、IκK及NF-κB的酶活性被激活,阳性表达增多(P＜0.05),反之IκB的阳性表达则减少(P＜0.05)。与模型组比较,YLSC各剂量能不同程度地抑制NIK、IκK及NF-κB的 阳 性 表达(P＜0.05或P＜0.01),且减少IκB的降解,增加IκB的阳性表达(P＜0.05或P＜0.01),呈剂量依赖关系。结果表明,YLSC对MI/RI大鼠具有保护作用,其能通过调控NIK/IκK/IκB/NF-κB信号通路中相关酶的活性来阻断后续损伤。结果见表4和图4。

图4 YLSC对MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影响Figure 4 Effect of YLSC on protein expression level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat

表4 YLSC对MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影响(±s)Table 4 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat

表4 YLSC对MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影响(±s)Table 4 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat

注:与假手术组比较, *P＜0.05;与模型组比较, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the sham group, *P＜0.05. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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3 讨论

NIK是IκK的上游激酶,其能通过级联反应引起IκK的活化,IκK的活化继而使得IκB发生磷酸化,磷酸化后的IκB被蛋白酶体识别继而解体,即解除了NF-κB-IκB复合物的聚集,复合物的解体使得NF-κB恢复了游离和活性状态,同时也让NF-κB的DNA结合结构域处于裸露状态,则NF-κB将与细胞核内相关基因激活区接轨,启动转录多种免疫因子[11]。由此得出,若是IκB的降解过程受到阻断或干扰,将会造成NF-κB-IκB复合物的解体失败,则NF-κB无法暴露核定位序列,其诱导的炎症反应和炎症因子的释放也将无法激活。付海荣等[12]发现,MI/RI大鼠心肌组织中NF-κB表达升高,反之IκB蛋白表达却呈下降趋势,阳性对照药复方丹参片及受试药能逆转该势态;同时邓红等[13]也发现在肺缺血再灌注损伤大鼠模型中,肺脏组织中的NF-κB被激活,蛋白表达显著上调;在Yu等[14]的研究中也发现了,慢性心衰患者在给予中药参附汤干预之后,能阻断NF-κB通路的酶活性并抑制促炎因子的释放,改善心功能的同时有效减缓了心力衰竭患者的病理进程;周玥等[15]的研究发现,吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)作为NF-κB的专属性抑制剂,其能有效阻断NF-κB信号传导通路的活化,下调心肌组织中NF-κB的酶活性,且能减轻炎症介质的释放;杨敏华等[16]研究发现,在脂多糖诱导的脓毒症大鼠模型中,使用核因子特异性抑制剂PDTC进行干预,能改善脓毒症大鼠心脏、肺病理损伤程度和炎症反应。可见,寻找对NIK/IκK/IκB/NF-κB信号通路具有针对性调控作用的靶点药物,也成为了MI/RI疾病治疗研究的急切任务。

该项实验结果也与上述研究相呼应,MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB通路被激活,各类激酶活性增强、IκB降解增多、NF-κB得以激活,提示MI/RI大鼠心肌组织损伤与该条通路的表达上调密切相关,受试药YLSC则是通过抑制该通路的各激酶活性、减少复合物的解体、阻止核因子核定位序列的暴露阻断了该通路介导的下游炎症反应。近年来大量的研究证实了,NF-κB家族作为一种联通各类免疫、炎症、增殖、分化、凋亡、氧化应激的重要通路,参与了多种病理生理过程,其同时也存在于心肌细胞中介导缺血性心肌病、心肌炎、心肌细胞凋亡及坏死等,而有效的对抗该条通路即能为MI/RI的防治开辟更多防治路径[17]。

另外,实验表明,尾静脉注射YLSC给药预处理可明显缩小MI/RI大鼠的心肌梗死范围。急性MI/RI时患者的心肌梗死范围对预后有着很大的影响,且患者的心梗并发症及病死率也与心梗面积的大小密切相关[18]。据研究表明,当缺血性心肌病发生后,其衰减的心功能预后好坏受梗死面积影响,心肌梗死面积越小则预后越好,因而缩小心梗面积可作为抗心肌缺血药物的主要疗效指标[19],而该项研究的实验结果也印证以上结论。此外,当心肌细胞受损后,相应的心肌酶如CK、CK-MB等会随着细胞膜的破坏而漏出到细胞外,并进入到血流中,故检测血中心肌酶活性可反映心肌受损程度[20],给与YLSC预处理能减少CK和CK-MB的活性,减少心肌酶的漏出,改善心肌受损程度;Hyp是胶原组织的主要成分之一,当体内结缔组织大量增生或破坏时,其在血、尿中的含量会显著增加,因此通过对血液和尿液中羟脯氨酸的测定,可了解体内组织胶原蛋白分解代谢情况[21],给与YLSC预处理能减少MI/RI大鼠血中Hyp含量,提示YLSC能减少心肌组织的胶原代谢、减轻心肌组织的损伤和心肌细胞的坏死分解。

综上所述,YLSC对MI/RI大鼠受损心肌具有保护作用,其能减少MI/RI大鼠心梗面积,减少血中CK、CK-MB和Hyp水平,调控NF-κB信号转导通路中相关蛋白的表达,实验结果可为后续研究YLSC治疗MI/RI提供基础,也为YLSC进一步的探索开发提供科学依据。