NEIL3调控p53信号促进卵巢癌进展的分子机制研究①

廖振蓉 申昌梅 余瑛（赣州市肿瘤医院，赣州 341000）

卵巢癌是导致女性患者死亡的主要恶性肿瘤之一，严重威胁女性生命健康。由于症状隐匿性强、体征出现较晚、早期诊断方法缺乏，卵巢癌初次确诊时间较晚，发生远处转移概率较高，且治疗后复发率也相对较高，五年生存率往往低于40%［1-3］。然而，当前手术治疗和放射治疗仍然是卵巢癌最主要的治疗手段，短时间内并无新的治疗策略或治疗药物［1-3］。导致这种状况的主要因素是对卵巢癌发病及进展的深层分子机制认识太少，因而挖掘卵巢癌的决定性因子并阐明其分子机制是当前及未来较长时间内的重要任务。

DNA损 伤 应 答 反 应（DNA damage response，DDR）是维持DNA完整性和稳定性的重要机制。研究发现肿瘤细胞常伴有DDR缺陷，导致基因损伤积累，最终引起肿瘤发生［4-5］。

本研究主要探讨DDR相关蛋白NEIL3在卵巢癌组织中的表达与卵巢癌分级的相关性，并通过体外实验观察NEIL3对卵巢癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，同时验证NEIL3与p53信号通路在卵巢癌中的作用及机制，为卵巢癌的早期诊断、预防、靶向治疗及抗肿瘤药物的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料卵巢癌组织和癌旁组织（距离病灶3 cm范围）标本来源于赣州市肿瘤医院病理科2016年8月至2019年9月保存的冰冻组织标本，癌组织取自原发灶，对应的癌组织和癌旁组织均取自同一个体，临床信息完整。共38例，患者均知情同意。

卵巢癌细胞株SKOV-3、人正常卵巢上皮细胞株IOSE80购于中国科学院细胞库；RPMI1640、FBS、胰酶（Gibco）；NEIL3-siRNA（苏州泓迅生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒、CCK-8、DMSO、细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术公司）；NEIL3、GAPDH引物（上海捷瑞生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1细胞转染与基因敲减生物学网站分析并设计靶向人源基因NEIL3的siRNA寡核苷酸，然后以脂质体法导入细胞，siRNA靶向敲减细胞中NEIL3基因的表达。胰酶消化，计数，将SKOV-3、IOSE80以1×106个/ml接种于6孔板，无双抗培养，细胞密度达到60%～80%时进行细胞转染。①阴性对照：2 μl Lipo/100 μl无血清无双抗培养基；②2 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl无血清无双抗培养基；③5 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl无血清无双抗培养基；④7 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl无血清无双抗培养基，将混合物加入6孔板，轻摇混匀，37℃培养箱中培养4 h，更换含10%FBS的RPMI1640培养基，24 h、48 h、72 h后收集细胞备用。每组设3个复孔，所有试验均重复3次。

1.2.2细胞增殖检测（CCK-8法）收集转染后的各组细胞，以3 000个/孔分别接种于96孔板。分别培养24 h、48 h、72 h后每孔加入10 μl CCK-8试剂，孵育4 h后酶标仪检测450 nm处的吸光度值，计算细胞增殖能力。每组设3个复孔，所有试验均重复3次。

1.2.3细胞凋亡分析收集转染后的各组细胞，以预冷PBS重悬后再次离心收集细胞，然后按照细胞凋亡检测试剂盒使用说明书进行流式检测分析凋亡率。简述如下：以100 μl结合液重悬细胞，加入10 μl Annexin V-FITC染料，混匀后避光37℃孵育15 min，再加入400 μl结合液，混匀后，上机检测凋亡率。每组设3个复孔，所有试验均重复3次。

1.2.4Transwell小室实验胰酶消化转染24 h后的细胞以1×104个/孔分别接种于24孔板中悬挂的滤膜孔径为8 μm的小室中，下室加入600 μl含20%FBS的RPMI1640培养基。分别于24 h、48 h、72 h后取出小室，甲醇固定，结晶紫染色，棉签轻拭小室滤膜上层。显微镜下观察，随机选取10个不同的视野拍照，计数。每组设3个复孔，所有试验均重复3次。

1.2.5实时荧光定量PCR分析收集转染后的各组细胞，Trizol裂解细胞，RNA提取试剂盒提取总RNA。取1 μg总RNA根据反转录试剂盒使用步骤进行反转录制备cDNA。以GAPDH为内参，1 μg cDNA为模板，20 μl总反应体系，95℃5 min，（95℃15 s、60℃1 min）×45个循环，72℃延伸。每组设3个复孔，所有试验均重复3次。

1.3统计学分析应用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析，定性分析采用χ2检验，两组间比较采用t检验，生存曲线采用Kaplan-Meier法，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1NEIL3与卵巢癌临床病理因素具有相关性qPCR检测表明卵巢癌组织中NEIL3 mRNA的表达量是癌旁组织中的3.58倍，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1A）。Kaplan-Meier分析发现，NEIL3表达量与卵巢癌患者的生存期呈负相关，NEIL3mRNA表达量高的卵巢癌患者五年生存率明显低于NEIL3 mRNA表达量低的患者（P=0.004，图1B）。

图1 NEIL3基因表达的临床意义Fig.1 Clinical significance of expression of NEIL3 gene

2.2NEIL3促进卵巢癌细胞生长如图2A，qPCR检测发现卵巢癌细胞SKOV-3中NEIL3 mRNA表达比人卵巢表皮细胞IOSE80提高15倍，差异具有统计学意义（P＜0.05）。本实验设计合成了NEIL3-siRNA（siNEIL3），并成功敲减NEIL3表达。如图2B所示，siNEIL3敲减效率达到90%。SKOV-3细胞的增殖能力随之减弱。如表1，CCK-8检测结果显示，与对照组相比，转染siNEIL3后第5天，SKOV-3增殖能力减弱34%，差异有统计学意义（P＜0.05）。在卵巢癌A2780细胞中，第5天后敲减组比对照组细胞增殖能力也显著降低（P＜0.05）。提示NEIL3促进卵巢癌细胞的生长。

表1 CCK-8法检测敲减NEIL3基因后SKOV-3细胞的增殖情况Tab.1 Proliferation of SKOV-3 cell after knockdown of NEIL3 gene detected by CCK-8 assay

图2 敲减NEIL3基因可抑制SKOV-3细胞增殖Fig.2 Knockdown of NEIL3 gene inhibited proliferation of SKOV-3 cells

2.3敲减NEIL3抑制卵巢癌细胞迁移Transwell小室实验检测NEIL3对SKOV-3细胞迁移能力的影响。结果显示，转染siNEIL3降低NEIL3表达后，SKOV-3细胞穿过Transwell小室滤膜的数量明显减少，细胞迁移能力较对照组降低53%，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。提示NEIL3对卵巢癌细胞迁移具有促进作用。

图3 敲减NEIL3基因抑制SKOV-3细胞转移Fig.3 Migration of SKOV-3 cell was inhibited by knockdown of NEIL3 gene

2.4敲减NEIL3促进卵巢癌细胞凋亡利用流式细胞术检测转染siNEIL3后SKOV-3细胞凋亡情况。如图4所示，敲减NEIL3后SKOV-3细胞凋亡率接近8%，而对照组凋亡率不到1%，凋亡率升高近8倍，差异具有统计学意义（P＜0.05）。该数据表明NEIL3具有保护卵巢癌细胞免受凋亡的作用。

图4 敲减NEIL3基因诱导SKOV-3细胞凋亡Fig.4 Knockdown of NEIL3 gene induced apoptosis of SKOV-3 cell

2.5NEIL3通过p53调控下游分子表达qPCR检测凋亡相关基因的表达水平。如图5所示，p53、p21、Bax及caspase-3基因的mRNA表达水平显著提高。NEIL3敲减组较对照组分别提高6.47、7.33、2.82、5.44倍。相 反，NEIL3敲 减 组 中Bcl-2的mRNA表达水平较对照组降低约80%，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示NEIL3可能通过p53调控卵巢癌细胞凋亡。

图5 NEIL3调控SKOV-3细胞中p53相关分子表达Fig.5 NEIL3 regulated expressions of p53-related molecules in SKOV-3 cell

3 讨论

DNA碱基可能受到氧化、烷基化、脱胺和氧化性DNA损伤等许多内源性和外源性损伤，DNA碱基损伤诱导包括癌症、动脉粥样硬化、神经退行性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）、衰老等多种疾病的发生和发展。碱基切除修复（base-excision repair，BER）途径是主要的DNA修复途径之一，DNA糖基酶是BER的关键酶，通过催化改性碱基和糖-磷酸主链间的N-糖基键的水解来启动修复［6-9］。迄今为止，四种识别和切除氧化碱基的哺乳动物DNA糖基化酶已被鉴定，分别为：OGG1、NTH1、NEIL1和NEIL2。NEIL3是最近被发现的第三种哺乳动物DNA糖基化 酶，与NEIL1和NEIL2同属于NEIL家族［10-12］。

NEIL家族是与大肠杆菌DNA糖酵素Fpg和Nei同源的蛋白质，NEIL1、NEIL2和NEIL3基因分别位于人类的15号、8号和4号染色体。NEIL3是一个68 kD的蛋白，其催化区域包含一个DNA结合口袋，能够将被氧化的DNA碱基从端粒四聚体中切除，从而将ssDNA底物中氧化的DNA损伤产物去除，在细胞快速分裂中修复受损的碱基中发挥重要作用［13-14］。NEIL3在增殖细胞中表达，处于S/G2期，已被报道为细胞周期调控基因，是与复制小体相关的DNA糖基化酶，提示其在维持复制叉的稳定性中发挥重要作用［15］。人NEIL3在胸腺和睾丸中表达，而小鼠NEIL3在脾脏、骨髓、胸腺、血细胞和大脑区域高表达［16］。此外，NEIL3也被证明与癌症的发生发展紧密相关。NEIL3的异常表达或突变会影响DNA复制效率，增加癌症发生的风险，并影响癌症的进展及治疗。在一些转移性癌症的病例中，NEIL3可能是维持癌细胞生长或恶性肿瘤进展所必需的。

有研究检测18个不同肿瘤组织和健康组织中hNEIL3 mRNA的表达水平，结果表明除睾丸和胰腺外，与正常细胞相比，肿瘤细胞内的NEIL3水平显著升高。NEIL3在原发性恶性黑色素瘤中高表达，与原发性恶性黑色素瘤的转移发展及其患者的高病死率相关。因此，有研究者认为高水平的DNA修复可能解释了黑色素瘤对化疗和放疗的耐药性。在包括GBM、LGG、PADC、LUAC、KRCCC和KPCCC等多数肿瘤中，NEIL3表达水平明显升高，同时促进肿瘤细胞的增殖和生长。NEIL3高表达水平与不同类型 癌 症（GBM、LGG、PADC、LUAC、KRCCC和KPCCC）患者的不良临床结果显著相关。此外，高NEIL3表达与三阴性表型（ER阴性、PR阴性、HER2阴性表型）间的相关性是支持预后较差的乳腺癌特定亚组的一个重要特征。相反，在胃癌和结直肠癌患者中，高NEIL3表达与更好的癌症特异性生存有关。因此，NEIL3可能在不同组织引起的癌症中发挥不同作用，NEIL3的上调可能影响不同类型肿瘤的进展［16-17］。

然而，NEIL3在卵巢癌中的作用及其机制尚不明确。本研究通过检测卵巢癌细胞及组织标本中NEIL3的表达水平，敲减NEIL3-siRNA在卵巢癌中的表达，较为系统地研究了NEIL3在卵巢癌中的表达情况和作用机制。首先，课题组检测到卵巢癌组织中NEIL3 mRNA的表达量高于癌旁组织，统计学分析显示，NEIL3在卵巢癌组织中的表达与卵巢癌病理分级及患者的生存时间有明显的相关性。在高分化的卵巢癌组织中，NEIL3 mRNA的表达量明显低于低分化的卵巢癌组织，NEIL3 mRNA表达量高的卵巢癌患者总生存期明显低于NEIL3 mRNA表达量低的卵巢癌患者，提示NEIL3表达上调可能参与卵巢癌的发生发展。通过CCK-8、Transwell小室、流式细胞术实验检测NEIL3对卵巢癌细胞恶性行为的影响，结果显示，NEIL3能够促进卵巢癌细胞的增殖和迁移，抑制其凋亡。敲减NEIL3后，通过荧光定量PCR技术检测SKOV-3细胞内p53、p21、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平。结果显示，p53、p21、Bax mRNA表达水平上调，Bcl-2 mRNA表达水平下调，差异有统计学意义（P＜0.05），提示沉默NEIL3可能激活p53依赖的凋亡信号通路，促进肿瘤细胞凋亡，从而调控卵巢癌细胞的生长、迁移和侵袭。

作为DDR的关键酶，NEIL3高表达的肿瘤可能具有更大的基因组不稳定性，NEIL3的高水平表达可能促进癌症表型基因组不稳定和/或干扰替代DNA修复，这种特殊的特征可能有助于解释NEIL3高表达卵巢癌细胞的恶性生物学行为和癌症患者的不良预后。本研究结果提示NEIL3可以作为一个潜在的药物靶点被探索，为卵巢癌的治疗策略和患者的预后评估指标开发提供了新思路。