小鼠骨髓中性粒细胞与脾脏中性粒细胞的异质性比较①

杨骁 张晓龙（西安交通大学第二附属医院科研中心实验室，西安 710004）

中性粒细胞是固有免疫系统中抵抗病原入侵的第一道防线，能够及时且有效地清除入侵细菌，同时也可诱发炎症反应进而引起组织损伤［1-2］。学术界传统观点认为，中性粒细胞是一类性质单一、终末分化、生命周期较短且增殖能力受限的细胞群体［3］。但越来越多的证据表明，中性粒细胞具有一定的异质性［4-6］。如肿瘤微环境中的中性粒细胞具有一定的功能异质性，一方面中性粒细胞可通过促进肿瘤细胞增殖、侵袭、免疫逃逸及肿瘤组织血管生成加速肿瘤的发生与发展；同时，中性粒细胞亦可促进T细胞抗肿瘤效应，通过产生杀伤肿瘤相关细胞因子以抑制肿瘤生长［7-9］。然而，中性粒细胞是否具有一定的组织特异性，其功能是否受组织微环境调控，仍有待阐明。本研究通过检索ImmGEN数据库，获得了骨髓中性粒细胞与脾脏中性粒细胞转录组表达相关数据［10-11］。本研究首先分析了骨髓与脾脏中性粒细胞相关细胞因子的基础表达水平；随后开展了相关功能学实验，探讨骨髓与脾脏中性粒细胞的炎症因子表达能力、LPS刺激后炎症反应能力、LPS刺激后自发凋亡水平、吞噬细菌能力等几个方面可能存在的细胞功能学差异。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实 验 动 物9只SPF级C67BL/6J小 鼠，6～8周龄，体质量21～23 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2016-0006］。本研究所有动物实验依据优化、减少、替代的3R原则设计，经过西安交通大学动物实验伦理委员会批准，动物福利伦理批件号：XJTULAC2018-2225。

1.1.2主要试剂与仪器小鼠Ly6G-PE-Cy7、CD11b-APC流式抗体（1∶200，Biolegend，美国）；RPMI1640培养基、胎牛血清（Gibco，美国）；RNA提取试剂Trizol（Invitrogen，美国）；cDNA合成试剂盒（Thermo，美国）；SYBR Green荧光定量盒（TaKaRa，日本）；引物序列合成（北京六合华大基因科技股份有限公司）；Annexin V-PI凋亡检测试剂盒（Sigma，美国）；FITC染料（上海翌圣生物科技有限公司）；大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α（北京全式金生物有限公司）；流式细胞仪为ARIAⅡ（BD，美国）；Nanodrop微量分光光度计（Thermo，美国）。

1.2方法

1.2.1流式分选小鼠骨髓与脾脏中性粒细胞取3只C67BL/6J小鼠，脱颈处死，采用75%乙醇浸泡消毒后，于超净台内解剖小鼠，剥离肌肉组织，取出四肢股骨、后肢胫骨和髂骨，PBS-EDTA缓冲液反复灌洗出骨髓细胞；同时，解剖取出小鼠脾脏组织，研磨后获得脾脏细胞。将收集的骨髓细胞用200目尼龙膜过滤后计数，1 650 r/min、4℃条件下离心10 min，重悬后取2×108个骨髓细胞和5×108个脾脏细胞，分别加入20 μl的Ly6G-PE-Cy7抗体和CD11b-APC抗体，避光冰上孵育30 min后，离心去上清，将细胞加入10 ml流式缓冲液重悬，过200目无菌滤网后上机进行流式细胞分选；分别选取1×106个骨髓细胞和脾脏细胞，分别加入1 μl的Ly6G-PE-Cy7抗体和CD11b-APC抗体，行上述流式抗体染色步骤，流式细胞术检测中性粒细胞比例，具体步骤参考文献［12-13］。通过流式分选，获得了2×107个Ly6G+CD11b+骨髓或脾脏中性粒细胞，均分为3部分，分别用于LPS作用后炎症因子表达实验、LPS作用后中性粒细胞自发凋亡实验及中性粒细胞吞噬细菌实验，所有实验均至少开展3次独立重复实验。

1.2.2LPS刺激骨髓和脾脏中性粒细胞将收集的中性粒细胞计数，接种于12孔板，以5×105个/孔，实验共分为4组，每组设置3个复孔，分组为骨髓中性粒细胞对照组（空白培养基）、骨髓中性粒细胞实验组（LPS刺激）、脾脏中性粒细胞对照组（空白培养基）、脾脏中性粒细胞实验组（LPS刺激），LPS浓度为100 ng/ml，作用6 h，收集细胞提取RNA，qRT-PCR检测炎症因子表达；同时，重复以上实验步骤，将实验分为两组，分别为骨髓实验组和脾脏实验组，LPS作用时长调整为12 h，收集细胞行Annexin V和PI双染，流式细胞术检测中性粒细胞的自发凋亡。

1.2.3实时荧光定量PCR检测收集处理后的中性粒细胞提取总RNA，采用Nanodrop微量分光光度计测定提取RNA的含量与质量（OD值1.8～2.0），取1 μg左右的RNA，利用cDNA合成试剂盒反转录为cDNA。采用SYBR Green检测目的基因mRNA表达水平，按照说明书将反应体系设置为20 μl，扩增程序设为：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，60℃复性及延伸1 min，40个循环；每个样品均设置3个技术重复。采用2-ΔΔCt相对定量法进行目的基因相对表达量分析，以加入空白培养基的骨髓中性粒细胞基因的表达设置为参照（RQ=1），具体步骤参照文献［14-15］。本研究涉及的引物信息见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物信息Tab.1 Primers for qRT-PCR detection

1.2.4中性粒细胞凋亡实验 参照试剂盒说明书，收集中性粒细胞于15 ml离心管，1 000 r/min离心10 min；用预冷的PBS洗涤2次，1 000 r/min离心10 min；用100 μl的Binding Buffer重悬，加入2 μl Annexin V-APC抗体，混匀，避光，冰上孵育15 min；加入250 μl的Binding Buffer重悬，转至流式管，上机前加入1 μl PI溶液（50 μg/ml），2 min后，迅速上机检测。其中，Annexin V+PI-的细胞群为早期凋亡细胞群，Annexin V+PI+的细胞群为晚期凋亡细胞群。

1.2.5中性粒细胞吞噬E.coli实验取对数生长期的E.coli，PBS洗涤2次；用PBS（pH=7.2）配成浓度为0.5×109个/ml的悬液，加入二甲基亚砜（DMSO）配成的FITC溶液储存液（10 mg/ml），实验时将菌液中的FITC调整至工作浓度（5 μg/ml）；然后于37℃放置1.5 h，取出离心，弃上清，PBS洗涤2次；1%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2次，配成浓度为1×109个/ml的悬液，避光保存于4℃备用。取1.2.1获得的小鼠骨髓与脾脏中性粒细胞，浓度调整至5×106个/ml，取100 μl加入至1.5 ml离心管，加入10 μl FITC标记后 的E.coli工 作液，混匀后 置于37℃水浴锅孵育15 min后，迅速取出置于冰上10 min，将实验样本移入流式管，使用预冷的PBS洗涤1遍，1%多聚甲醛固定后，行流式细胞术检测。

1.3统计学分析采用FlowJo软件对流式数据进行分析，使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析，实验数据采用±s表示，采用Levene法行方差齐性检验，组间比较采用非配对t检验或Mann-Whitney检验，以P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1骨髓与脾脏中性粒细胞相关细胞因子表达的比较经检索ImmGen数据库中小鼠Ly6G+CD11b+骨髓与脾脏中性粒细胞RNAseq测序数据，获得了骨髓和脾脏中性粒细胞表达中性粒细胞相关细胞因子的差异。以表达倍数＞2为高表达标准，发现骨髓中性粒细胞高表达的CC型趋化因子为CCL5，高表达的CXC型趋化因子为CXCL12、CXCL13，高表达的免疫调节细胞因子为IL-12A，高表达的促血管生成或促纤维化细胞因子为FGF2，高表达的其他细胞因子为Activin A，共占统计中性粒细胞相关细胞因子的11.36%（5/44）。而在脾脏中性粒细胞高表达的CC型趋化因子有CCL2、CCL3、CCL4，高表达的CXC型趋化因子为CXCL1、CXCL2、CXCL4、CXCL9，高表达的促炎细胞因子为IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18，高表达的免疫调节细胞因子为IL-10、IL-12β、IL-21，高表达的集落刺激因子为CSF1，高表达的抗炎细胞因子为TGFB1，高表达的TNF超级组成员为TNF、TNFSF13B，高表达的促血管生成或促纤维化细胞因子为TGFA，高表达的其他细胞因子为MDK，占统计中性粒细胞相关细胞因子的45.45%（20/44）。以上结果表明，骨髓与脾脏中性粒细胞相关细胞因子的基础表达水平具有一定的差异，具体结果见附表1（www.immune99.com）。

2.2流式细胞术分选小鼠骨髓与脾脏中性粒细胞流式结果表明，Ly6G+CD11b+骨髓中性粒细胞占骨髓白细胞总数的（30.33±1.01）%，共分选获得2×107个骨髓中性粒细胞；Ly6G+CD11b+骨髓中性粒细胞占脾脏总细胞数的（3.63±0.14）%，共分选获得2×107个脾脏中性粒细胞，见图1。

图1 流式细胞术分选Ly6G+CD11b+骨髓和脾脏中性粒细胞Fig.1 Sorting Ly6G+CD11b+neutrophils from bone marrow and spleen by flow cytometry

2.3LPS诱导骨髓和脾脏中性粒细胞炎症相关细胞因子的表达结果显示：LPS作用后骨髓中性粒细胞IL-1β表达（2.37±0.25）较对照组（1.03±0.06）提高2.3倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。IL-6表达（4.28±0.51）较对照组（1.05±0.09）提高4.08倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。TNF表达（5.50±0.36）较对照组（1.08±0.06）升高约5.09倍，具有显著性差异（P＜0.05）。同时，LPS作用后脾脏中性粒细胞L1B表达（6.21±0.59）较对照组（22.80±5.80）提高3.67倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。IL-6表达（13.64±0.83）较对照组（21.22±1.27）提高1.56倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。TNF表达（2.89±0.36）较对照组（0.85±0.05）提高约3.4倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明，在LPS作用下，骨髓中性粒细胞和脾脏中性粒细胞均具有较强的炎症反应能力；考虑到脾脏中性粒细胞IL-1β和IL-6等炎症因子的基础表达量明显高于骨髓中性粒细胞（图2），脾脏中性粒细胞的分泌炎症因子的能力要强于脾脏中性粒细胞。

图2 炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNF的mRNA表达水平Fig.2 mRNA expression levels of inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF

2.4LPS对骨髓和脾脏中性粒细胞自发性凋亡的影响 结果显示：LPS作用12 h后，骨髓中性粒细胞晚期凋亡细胞比例［（7.65±0.99）%］与脾脏中性粒细胞晚期凋亡比例［（8.53±0.81）%］差异无统计学意义；同时骨髓中性粒细胞早期凋亡细胞比例［（53.93±2.30）%］与脾脏中性粒细胞早期凋亡比例［（55.78±1.71）%］差异无统计学意义。以上结果表明，LPS作用后骨髓中性粒细胞与脾脏中性粒细胞自发凋亡差异无统计学意义，见图3。

图3 流式细胞术检测骨髓和脾脏中性粒细胞凋亡Fig.3 Apoptosis of bone marrow and splenic neutrophils by flow cytometry

2.5骨髓与脾脏中性粒细胞吞噬细菌能力比较结果显示：骨髓中性粒细胞吞噬率为［（78.94±1.36）%］，显著高于脾脏中性粒细胞［（42.28±1.34）%，P＜0.05］。结果表明，骨髓中性粒细胞吞噬细菌的能力显著高于脾脏中性粒细胞，见图4。

图4 骨髓和脾脏中性粒细胞吞噬大肠埃希菌的流式分析图Fig.4 Flow cytometre analysis of E.coli phagocytosis by neutrophils from bone marrow and spleen

3 讨论

机体免疫系统中的吞噬细胞主要由单核/巨噬细胞和中性粒细胞两大类构成［16-17］。其中，巨噬细胞不仅具有较强的吞噬功能，还是一类抗原递呈细胞，参与机体的固有免疫和特异性免疫的触发与调节［18-19］。而中性粒细胞主要参与针对入侵细菌的吞噬过程，相较于巨噬细胞，中性粒细胞参与的免疫反应速度快、强度高，往往继发性导致炎症损伤［20-21］。目前学术界对巨噬细胞的异质性进行了较为完善的阐述，按其功能表型、驻留器官、发育来源可划分为不同的异质性细胞亚群。如根据其促炎/抑炎免疫反应的功能表型，可划分为M1型巨噬细胞（经典活化型）和M2型巨噬细胞（选择活化性）［22］。根据其驻留器官，可划分为肝脏组织中的库佛细胞、皮肤组织中朗格的汉斯细胞、脑组织中的小胶质细胞、肺脏组织中的肺泡巨噬细胞、骨组织中的破骨细胞等［23］。根据其分化发育来源，可分为胎肝造血干细胞来源、胚胎造血干细胞来源、成体骨髓造血干细胞来源的巨噬细胞［24］。随着目前巨噬细胞异质性研究的不断深入，研究技术手段的不断更新，学术界对巨噬细胞在各类疾病中的复杂调控机制进行更为清晰地阐明。然而目前国内对中性粒细胞异质性的研究还较少，通过设置“中性粒细胞”“异质性”为检索词，发现知网中仅有一篇综述对肿瘤相关中性粒细胞的功能异质性进行了总结［25］。因此，在功能学层面对不同组织来源的中性粒细胞的异质性进行阐述，将有助于对中性粒细胞的免疫调控机理进行更为深刻的理解，为基于中性粒细胞的免疫干预调控提供更为精准的理论指导。

本研究首先比较了ImmGEN数据库中骨髓与脾脏中性粒细胞相关细胞因子的表达，发现脾脏中性粒细胞高表达的细胞因子占到统计指标总数的45.45%，远高于骨髓中性粒细胞高表达细胞因子数量（11.36%）；同时，二者对LPS的刺激均能够做出较强的免疫应答，考虑到脾脏中性粒细胞相关细胞因子的基线表达水平较高，表明脾脏中性粒细胞参与免疫反应释放炎症因子的能力更强。推测该功能差异可能与其所处骨髓或脾脏微环境调控相关，而其具体机制还需要更进一步深入研究。同时还发现，骨髓和脾脏中性粒细胞在LPS作用后，其自发凋亡水平无明显差异，表明其在较短生命周期特征这一方面，并未表现出异质性。然而，在吞噬功能方面，骨髓中性粒细胞吞噬功能显著高于脾脏，其可能存在的机制亦需后续实验进一步阐明。

骨髓是人体的造血器官，同时也是包括人类在内所有哺乳动物免疫系统发生的重要场所。骨髓微环境内定居着大量造血干细胞、造血祖细胞、不同发育阶段的各种免疫细胞与各类基质细胞，通过细胞-细胞间接触和分泌细胞因子调控骨髓微环境的稳态与骨髓微环境中细胞的功能［26］。脾脏是人和动物体内外周环境最大的免疫器官，尽管成年小鼠脾脏具备一定的造血功能，但成年人类脾脏的造血功能已逐渐消退，只有当机体严重贫血和某些病理状态时，才恢复其造血功能［27］。因此在机体稳态环境下，脾脏主要具有机体免疫细胞储存、直接参与免疫反应等功能。综上，推测骨髓与脾脏中免疫细胞的异质性，可能与其所处的骨组织与脾脏组织微环境的构成、功能、稳态维持策略、免疫反应调控机制等密切相关；同时，骨髓与脾脏中免疫细胞可能在发育成熟度上亦存在一定差异。

综上，相较于脾脏中性粒细胞，骨髓中性粒细胞具有更强的吞噬能力；在释放炎症细胞因子的免疫反应中，相较于骨髓中性粒细胞，脾脏中性粒细胞能释放更多的炎症细胞因子。二者在吞噬能力和炎症因子释放能力两方面展现出一定的异质性。然而，针对中性粒细胞生命周期较短这一特征，骨髓中性粒细胞与脾脏中性粒细胞并未展现出差异性。本研究初步研究了骨髓中性粒细胞与脾脏中性粒细胞功能学水平的异质性，对未来基于中性粒细胞异质性的免疫疾病机制研究物奠定了理论和实验基础。