血清趋化因子12基因多态性与缺血性脑卒中的关系

刘小霞，张彦伟，岳 毅，刘少凯，王春晖，张彦清

脑梗死又称缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)，是指脑部血液循环障碍导致的脑组织坏死，占所有脑卒中病人的75%～80%，是我国成年人群死亡、严重致残的重要原因之一。缺血性脑卒中分布具有明显的年龄、性别、地域、城乡差异[1]。缺血性脑卒中的发生除与高血压、糖尿病、血脂异常、心脏病、吸烟、饮酒以及肥胖等可改变的危险因素相关外[2-5]，也与遗传因素相关[6-10]。血清趋化因子 12 (chemokine C-X-C motif-ligand-12，CXCL12)可表达于脑血管内皮细胞，在血管重塑与血管再生过程中发挥重要作用[11]。此外，CXCL12在动脉粥样硬化病变中表达，对血管重塑和新内膜形成具有重要意义[12-13]。研究表明，血浆中高水平 CXCL12 可能与缺血性脑卒中发生的风险升高密切相关[14-15]。有研究表明，部分CXCL12基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能与CXCL12的血浆水平密切相关[16]，且与缺血性脑卒中的发生风险增加有关，但结果颇有争议[17-18]。目前，CXCL12基因多态性与缺血性脑卒中的研究相对较少。本研究拟通过病例-对照研究，根据既往阳性结果及查阅文献，筛选CXCL12基因SNP rs501120，探讨其基因型、等位基因与老年缺血性脑卒中病理特征的关系，为临床从基因遗传水平深入了解缺血性脑卒中发病机制、疾病的诊治和预防等提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月—2019年12月山西医科大学第一医院神经内科收治的缺血性脑卒中病人160例为病例组，男93例，女67例；年龄(72.70±9.42)岁。纳入标准：①符合全国第四届脑血管病学术会议修订的缺血性脑卒中的诊断标准；②经头颅磁共振成像(MRI)或头颅CT确诊；③汉族，年龄>65岁。排除标准：①出血性梗死；②其他病因学亚型；③其他合并脑外伤、血液系统疾病、动脉瘤、恶性肿瘤的病人。从同期山西医科大学第一医院体检中心选取233名年龄和性别相匹配的健康对照者为对照组，男131名，女102名；年龄(72.55±5.97)岁；经头颅CT、MRI排除心脑血管疾病病史。本研究通过山西医科大学第一医院伦理委员会审查(编号：〔2020〕-K010)，且入选对象均自愿签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 用调查问卷形式收集一般资料，包括性别、年龄、身高、体重、高血压病史、糖尿病病史、高脂血症、冠心病病史、吸烟史、饮酒史等。

1.2.2 DNA提取 采集所有研究对象清晨空腹静脉血5 mL，加入2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，-20 ℃冰箱保存备用，取出样本并在室温条件下解冻，应用标准方案使用全基因组DNA试剂盒(太原市莱博瑞生物科技有限公司)按说明书提取DNA，将提取的DNA保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 聚合酶链式反应(PCR) 通过文献查阅及美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库搜索，筛选 CXCL12基因 SNP 位点rs501120。采用Premier 5.0进行引物设计(武汉君诺德公司)，引物序列：正向引物为5′ -CAGCAAAGACGGAGGAG-3′，反向引物为5′-GCATGTGAACCTACAACTC-3′。基因分型采用PCR，首先进行PCR扩增，PCR总反应体系为10 μL：基因组DNA 1 μL，2xTap PCR Master mix，正向引物设1 μL，反向引物设1 μL，双蒸水(ddH2O)6 μL。PCR扩增条件：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，扩增30个循环后，终末延伸72 ℃ 7 min。电泳检测：取扩增物5 μL，予以3%的琼脂凝胶电泳，使用限制性内切酶2 U消化扩增产物，然后37 ℃孵育过夜，以含溴化乙啶的 3% 琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。

2 结 果

2.1 病例组和对照组一般资料比较 病例组和对照组在性别、年龄、体质指数(BMI)方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组高血压、糖尿病、高脂血症、冠心病、吸烟史、饮酒史比例均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 病例组和对照组一般资料比较

2.2 基因多态性与缺血性脑卒中的关系 病例组和对照组rs501120位点的基因频率分布均遵循Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)，具有人群代表性。两组rs501120 CT、TT基因频率、T等位基因频率分布差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2、表3。

表2 两组rs501120基因型频率比较 单位：例(%)

表3 两组等位基因频率比较 单位：例(%)

2.3 缺血性脑卒中相关危险因素的Logistic回归分析 Logistic回归分析显示，在调整性别、年龄、吸烟、饮酒、冠心病、高脂血症、吸烟史和饮酒史后，rs501120位点TT基因型是缺血性脑卒中的独立危险因素(P<0.05)；男性、高血压、高脂血症、冠心病、吸烟史、饮酒史均是缺血性脑卒中的独立影响因素(P<0.05)。详见表4。

表4 缺血性脑卒中相关危险因素的Logistic回归分析

2.4 CXCL12基因rs501120与缺血性脑卒中传统危险因素的交互作用 将Logistic回归分析中P<0.05的变量与样本资料导入MDR软件，制作1～3阶不同交互作用情况下的模型。结果显示，3阶交互模型rs501120多态性、高血压、吸烟史具有最好的平均检验准确度(0.682 6)，因此，选择此模型作为最佳模型(见表5)。

表5 CXCL12基因rs501120多态性与传统危险因素基于1～3阶交互作用分析

3 讨 论

本研究结果显示，病例组与对照组rs501120 TT基因型、T等位基因频率分布差异均有统计学意义(P<0.05)，提示携带rs501120TT基因型与缺血性脑卒中风险增高相关。研究表明，CXCL12作为一种趋化因子，与动脉粥样硬化的发生密切相关[12-13]，血清CXCL12蛋白水平受rs501120位点的调控[16]。本研究发现，rs501120与缺血性脑卒中的发生风险相关。目前，关于CXCL12基因 rs501120多态性与老年缺血性脑卒中的关联性研究在我国人群中报道较少。GWAS研究表明位于10q11.21染色体上的关键基因rs501120与冠心病的发生风险相关[19-21]。Samani等[22]进行了冠心病的GWAS研究，结果显示SNP rs501120的T等位基因与冠心病风险增加之间存在关联，随后的大规模研究也验证了CXCL12 rs501120与冠心病有关[23]。Kiechl等[16]研究发现，rs501120 T等位基因与血浆CXCL12水平降低和颈动脉内膜中层厚度增加，可作为动脉粥样硬化的早期标志物以及心血管疾病风险的预测因子。Xie等[24]研究发现，CXCL12 rs501120多态性与冠状动脉粥样硬化的关联性仅限于女性。Zhu 等[17]研究表明，我国北方汉族人群中CXCL12 rs501120与缺血性中脑卒有关。然而Roder等[18]研究表明，rs501120并不会增加欧洲儿童患烟雾病的风险。这些有争议的发现可能是研究人群的不同而导致的。本研究发现，rs501120与老年缺血性脑卒中的风险增加有关，即使在调整了缺血性脑卒中的传统影响因素等混杂因素后，CXCL12 rs501120仍与缺血性脑卒中风险增加有关。

此外，本研究还对CXCL12 rs501120与缺血性脑卒中的传统危险因素进行了交互作用的分析。结果表明，rs501120与高血压病史、吸烟史2个因素存在交互作用，三者之间的交互作用可能与缺血性脑卒中风险增加有关，差异有统计学意义(P<0.001)。目前关于CXCL12 基因多态性的研究大多与冠状动脉粥样硬化、胃癌、乳腺癌及结肠癌等相关，但与缺血性脑卒中的研究较少。

本研究也存在一定的局限性。首先，样本量较小，应在大型队列中进一步研究；其次，只针对CXCL12基因的1个SNP位点以及高血压病史、糖尿病病史、冠心病病史、吸烟史、饮酒史等危险因素进行分析，在以后的研究中可考虑纳入更多的SNP。本研究结果表明，CXCL12基因 rs501120可能是我国汉族老年人缺血性脑卒中发病的易感基因，但关于rs501120影响缺血性脑卒中的病理生理学机制还需进一步研究。