基于网络药理学和分子对接技术探讨清眩降压汤治疗原发性高血压的作用机制

于宗良，李晓雅，2，张晓囡，马 鹤，2，王泽平，2，吴 敏，刘龙涛

原发性高血压是以体循环动脉压升高为主要临床表现的心血管疾病，常可造成多个靶器官损伤，并发冠心病、糖尿病等慢性疾病，是急性脑血管事件的独立危险因素之一[1]。近年来，随着人们生活方式的变化，我国高血压发病率呈逐年上升趋势，根据《中国心血管病报告2018》测算，我国高血压病人约2.45亿人，成年人高血压患病率高达27.9%，而控制率仅为16.8%[2-3]。原发性高血压的具体发病机制尚不完全清楚，目前无根治措施，主要以稳定降压、减少并发症发生为主要目的[4]。中医药作为联合治疗原发性高血压的重要手段，能够多靶点、多通路发挥降压作用，对于防止靶器官损害具有独特优势[5-7]。清眩降压汤由苦丁茶、天麻、钩藤、桑叶、菊花、黄芩、夜交藤、杜仲、生地黄、牛膝十味药物组成，是陈可冀院士治疗原发性高血压的数十年的经验总结，临床应用效果确切。本研究采用网络药理学和分子对接方法，探究清眩降压汤治疗原发性高血压的关键靶点和通路，为进一步研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 清眩降压汤相关靶点筛选 以苦丁茶、天麻、钩藤、桑叶、菊花、黄芩、夜交藤、杜仲、生地黄、牛膝为关键词检索中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug likeness，DL)≥0.18的2个药物动力学参数进行筛选以获得活性成分。检索中医药综合数据库(TCMID)、传统中药百科全书数据库(ETCM)挖掘药物成分数据及已发表的相关文献中研究较为成熟但参数未达到要求的活性成分，统一在TCMSP平台检索活性成分蛋白质靶点。根据已发表的文献补充未预测的活性成分已知靶点，并在UniProt蛋白质数据库对靶点进行规范。

1.2 原发性高血压相关靶点筛选 以hypertension、essential hypertension、spontaneous hypertension等关键词，检索GeneCards数据库中治疗原发性高血压的潜在靶点，根据经验设定Score值排序前1/4的目标靶点为原发性高血压潜在靶点，并通过OMIM数据库、TTD数据库及DrugBank数据库进行补充[8]。合并4个数据库靶点后，删除重复值，获得原发性高血压相关靶点。

1.3 清眩降压汤成分-原发性高血压靶点蛋白相互作用(PPI)网络构建 利用Venny 2.1将清眩降压汤中药作用靶点与原发性高血压靶点取交集并绘制韦恩图，得到清眩降压汤成分-原发性高血压共同靶点。将交集靶点提交至STRING 11.0数据库构建PPI模型，生物种类设为“Homo sapiens”，最小作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，假阳性率(FDR)严格设定为“high”(<1%)，其余设置默认，得到PPI网络[9]，导入Cytoscape 3.7.2进行网络图的绘制。

1.4 清眩降压汤成分-原发性高血压靶点功能与通路的富集分析 将清眩降压汤调节原发性高血压的靶点录入Metascape平台[10-11]，设置P<0.01，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，通过Bioinformatics平台实现可视化。

1.5 清眩降压汤成分-原发性高血压靶点-通路网络图构建 利用Cytoscape 3.7.2构建清眩降压汤成分-原发性高血压靶点-通路网络图，利用Cytoscape 3.7.2内置工具分析有效成分、靶点和通路的网络拓扑参数，并分析核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.6 分子对接验证 选取Cytoscape 3.7.2分析结果度值排名前10位的活性成分和靶点进行分子对接验证。PubChem和PDB平台获取小分子配体和蛋白受体，以分辨率高和参考文献支持为筛选条件。通过ChemOffice对小分子配体能量最小化处理，通过PyMOL对蛋白配体进行移除水分子、小分子配体，AutoDockTools加氢、计算电荷并设置为刚性分子。选中所有活性位点，通过AutoDockTools设置对接盒子进行分子对接[12]，OpenBabel实现可视化，最后通过PLIP平台确定结合位点并可视化处理。

2 结 果

2.1 清眩降压汤相关靶点筛选 筛选后共获得苦丁茶活性成分11种、天麻活性成分13种、钩藤活性成分37种、桑叶活性成分33种、菊花活性成分26种、黄芩活性成分37种、夜交藤活性成分14种、杜仲活性成分33种、生地黄活性成分19种、牛膝活性成分23种，各中药重复成分见图1，合并后删除重复值，得到活性成分共计199种。苦丁茶作用靶点148个，天麻作用靶点41个，钩藤作用靶点176个，桑叶作用靶点191个，菊花作用靶点206个，黄芩作用靶点90个，夜交藤作用靶点153个，杜仲作用靶点170个，生地黄作用靶点49个，牛膝作用靶点173个，合并后删除重复值，得到靶点共计281个。

图1 清眩降压汤不同中药重复成分统计

2.2 原发性高血压相关靶点筛选 在GeneCards数据库得到原发性高血压相关靶点6 972个，根据经验设定Score值前1/4的目标靶点为原发性高血压潜在靶点。结合OMIM、TTD、DrugBank数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1 775个原发性高血压相关靶点。

2.3 清眩降压汤成分-原发性高血压靶点PPI网络构建 利用Venny 2.1将清眩降压汤活性成分作用靶点与原发性高血压靶点取交集并绘制韦恩图，得到清眩降压汤成分-原发性高血压共同靶点173个，详见图2。通过STRING 11.0平台构建蛋白互作模型，导入Cytoscape 3.7.2进行蛋白互作网络图构建，清除游离节点，共形成点154个、边728条，平均点度值8.42，平均聚类系数0.45，图3展示度值大于20的节点网络。

图2 清眩降压汤-原发性高血压作用靶点韦恩图

图3 清眩降压汤-原发性高血压靶点PPI网络(度值>20)(节点面积越大、颜色越深表示度值越大，提示节点越重要)

2.4 清眩降压汤成分-原发性高血压靶点功能与通路的富集分析 基因本体(GO)功能富集分析得到条目2 705个，其中生物过程(BP)条目2 391个，细胞组成(CC)条目120个，分子功能(MF)条目194个，分别占88.4%、4.4%、7.2%，详见图4。京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集筛选得到355条信号通路(见图5)。清眩降压汤成分参与的BP主要包括血管发育、对细胞外刺激的反应、对氧化应激的反应、对细胞运动的正向调节等。MF主要包括蛋白质均二聚活性、氧化还原酶活性、肾上腺素能受体活性、脂质结合、辅因子结合等。参与的相关通路主要有丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等，富集结果前20位相关靶点通路见表1。

表1 清眩降压汤调节原发性高血压通路富集分析

2.5 清眩降压汤成分-原发性高血压靶点-通路网络图构建 通过Cytoscape 3.7.2构建清眩降压汤成分-原发性高血压靶点-通路网络图，图6展示了度值排名前5%的活性成分、靶点和通路网络。网络分析显示，槲皮素度值为92，介度为0.194，紧密度为0.487，预测槲皮素可能为清眩降压汤治疗原发性高血压的主要活性成分，其次为芹菜素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素和大黄素等，详见表2。PTGS2在网络中度值为125，介度为0.227，紧密度为0.497，预测PTGS2为清眩降压汤治疗原发性高血压的最重要靶点。环加氧酶1(PTGS1)、雄激素受体(AR)、MAPK1、MAPK3、AKT1、一氧化氮合酶2(NOS2)、PRKCA、MAPK14、RELA等亦为相对重要的靶点，详见表3。

图6 清眩降压汤活性成分-原发性高血压靶点-通路网络图(度值排名前5%)(蓝紫色节点代表作用靶点，粉色节点代表通路，淡红色节点代表活性成分，节点面积代表度值，面积越大说明节点越重要)

表2 清眩降压汤主要活性成分药物特征及网络节点特征参数

表3 清眩降压汤主要成分靶点网络节点特征参数

2.6 分子对接验证 根据度值，选取排名前10位的活性成分与靶点进行分子对接验证，结合能越低，分子结合越稳定，对接效果越好，一般认为结合能低于-29.3 kJ/mol提示对接稳定。如图7所示，槲皮素、山奈酚、木犀草素与排名前10位的靶点均对接良好。大黄素与MAPK3、RELA结合能低于-41.8 kJ/mol，为对接效果最好的活性成分与靶点，其次为木犀草素与PTGS1、槲皮素与PTGS2，以及山奈酚与PTGS2，对接结合能均低于-39.7 kJ/mol。针对对接效果最好的五对分子-靶点对接进行可视化处理，可以看出结合以疏水键的相互作用和氢键为主，与在大黄素与RELA、木犀草素与PTGS1的对接中还存在π堆积作用，详见图8。

图7 清眩降压汤活性成分-原发性高血压靶点分析对接聚类热图

图8 清眩降压汤活性成分-原发性高血压靶点分子对接及对接位点示意图(A为大黄素与MAPK3对接结果；B为大黄素与RELA对接结果；C为木犀草素与PTGS1对接结果；D为槲皮素与PTGS2对接结果；E为山奈酚与PTGS2对接结果)

3 讨 论

原发性高血压发病率呈逐年上升趋势，且病人依从性差、疾病控制率低，常可导致多种急性并发症，严重威胁公众健康[13]。中药联合治疗高血压能够有效提高血压控制率，在改善症状、减少并发症方面具有独特优势[14]。清眩降压汤由苦丁茶、天麻、钩藤、桑叶、菊花、黄芩、夜交藤、杜仲、生地黄、牛膝十味药物组成，是陈可冀院士治疗原发性高血压的经验方，临床应用效果确切。临床研究证实，联合使用清眩降压汤能够有效降低原发性高血压病人全天收缩压和舒张压，显著降低中医证候积分，治疗肝阳上亢型、肝肾阴虚型原发性高血压疗效显著[15-16]。另有研究发现，清眩降压汤在治疗围绝经期原发性高血压、青年高血压及老年高血压方面同样可以发挥良好效果，能够有效改善病人症状，降低中医证候评分及血清血管紧张素Ⅱ、同型半胱氨酸水平[17-19]。由此可见，清眩降压汤治疗原发性高血压证型广泛，临床效果确切。大量实验研究对清眩降压汤生物学机制进行了探讨。如林珊等[20]采用大鼠离体胸主动脉环进行研究证实，清眩降压汤能够有效舒张血管，明显降低离体血管环收缩力。而在体实验研究则发现，清眩降压汤能够有效控制自发性高血压模型大鼠血压的进一步升高，减小血管中膜厚度，改善血压升高导致的动脉血管重构，其机制与降低Bcl-2蛋白表达、抑制血管平滑肌细胞增殖有关[21]。类似的研究则认为，清眩降压汤逆转自发性高血压大鼠血管重塑的机制可能与调节转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad通路及诱导血管平滑肌细胞凋亡有关[22-23]。整体而言，清眩降压汤治疗原发性高血压临床效果显著，其改善血管重构的机制主要与调节平滑肌细胞增殖与凋亡有关，而针对清眩降压汤的降压机制仍有待深入研究。

本研究通过网络药理学方法，初步筛选出清眩降压汤调节原发性高血压的活性成分为槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素和大黄素等。基础研究发现槲皮素能够降低自发性高血压大鼠收缩压，降低左室相对质量，并能够逆转高血压引起的心肌纤维破坏和线粒体损伤，其机制与激活过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR-γ)抑制核转录因子-κB(NF-κB)的表达，进而调节其下游肥厚基因心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)mRNA的表达有关[24]。周秀等[25]的研究则认为，槲皮素改善高血压诱导的心肌重构机制与调节肠道菌群下调Toll样受体4(TLR4)/NF-κB途径有关。木犀草素的降压机制研究相对较早，主要与调节离子通道、抑制炎性因子表达和抑制醛糖还原酶活性有关[26]，目前研究主要集中于木犀草素的肾性高血压心肌保护机制[27-28]。针对山奈酚的研究则证实了其良好的血管舒张作用，其机制可能与一氧化氮(NO)-环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信号通路有关[29]。芹菜素和大黄素的降压机制研究近年来得到了研究人员的广泛关注，研究发现芹菜素能够有效控制高脂高盐诱导的大鼠血压增高，改善高血压引起的心脏肥大，其作用机制可能与降低大鼠血管紧张素Ⅱ水平、改善抗氧化酶活性有关[30-31]。同时，芹菜素抗氧化应激作用能够有效减轻高血压诱导的肾间质纤维化及胶原沉积，发挥靶器官保护效应[32]，与大黄素的肾脏保护机制具有一致性[33-35]。本研究分子对接结果同样证实，槲皮素、木犀草素、山奈酚、大黄素等活性成分与主要靶点能够以疏水键的相互作用、氢键、π堆积作用发生对接结合，且结合强度较高。由此可见，清眩降压汤的降压作用可能是通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素和大黄素实现的。

本研究发现，清眩降压汤调控原发性高血压的主要靶点是PTGS2、PTGS1、AR、MAPK1、MAPK3、RELA等，主要为炎症应答、细胞增殖与凋亡、细胞因子转导相关靶点，与近年来原发性高血压慢性炎症过程的认识具有一致性[36]。清眩降压汤参与的生物过程主要包括血管发育、对细胞外刺激的反应、对氧化应激的反应等，分子功能主要包括氧化还原酶活性、脂质结合、辅因子结合等，均与炎症应答、氧化应激及代谢调节有关。涉及的生物学通路主要作用有MAPK、IL-17、PI3K-Akt、TNF等。近年来的研究表明，MAPK、TNF等炎性信号通路广泛参与了高血压心脏重构与血压调节过程[37]，并与PI3K-Akt等细胞周期信号通路协同作用，调节高血压大鼠血管内皮氧化应激损伤、平滑肌表型转化和胶原重构的过程[38-40]。故推测清眩降压汤主要通过调节MAPK信号通路、TNF信号通路等炎症通路及PI3K-Akt等细胞周期信号通路实现降压作用。

本研究借助网络药理学方法，分析清眩降压汤调节原发性高血压的机制。结果表明清眩降压汤的同一化合物可调控不同靶点，而同一靶点可干预不同的生物学过程及信号通路，体现了清眩降压汤多通路、多靶点联合作用调节血压的特点，为清眩降压汤治疗原发性高血压提供了科学依据和发掘清眩降压汤潜在作用机制的基础。但是网络药理学作为大数据背景下的新兴研究方法，主要通过数据挖掘方法进行活性成分和靶点关联的预测，可能与实验研究有一定出入，通过分子对接方法验证其预测结果具有重要意义。本课题组在借助数据库分析预测清眩降压汤治疗原发性高血压可能存在的靶点、通路等的基础上，进一步对筛选出的相关基因及蛋白进行验证，从细胞及分子层面明确清眩降压汤通过炎症通路、细胞周期信号调控原发性高血压的作用机制，为清眩降压汤治疗原发性高血压的中药组方的临床应用提供理论依据。