174例早期肺腺癌患者EGFR基因突变检测和临床病理特征分析

闫琛 徐小艳 徐宪伟 杨玉伦 杨金花

1 河南中医药大学第五临床医学院郑州人民医院病理科，郑州 450000；2河南中医药大学第五临床医学院郑州人民医院胸外科，郑州 450000；3中国肺癌防治联盟-郑州人民医院肺结节诊治分中心，郑州 450000

肺癌是临床上极为常见的恶性肿瘤之一，发病率与病死率都很高，严重威胁着人类的健康［1-2］。腺癌是常见的肺癌病理亚型，约占40%，由于其临床症状较为隐匿，发现时多为晚期［3-4］。近年来，随着肺癌筛查的普及和影像学技术的不断更新，早期肺腺癌的检出率得到了明显提高［5-6］。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的突变不仅参与了癌细胞的分化增殖及新生血管的生成，还与癌细胞的侵袭和转移有关，更直接影响到相关靶向药物的选择及疗效，在肺腺癌的发生发展、治疗过程及预后判断中均起着至关重要的作用［7-8］。因此研究不同时期的肺腺癌组织中EGFR基因的突变情况就显得尤为重要，以往的报道多集中在晚期肺腺癌组织，对早期肺腺癌组织中EGFR基因的突变情况的研究较少。本研究检测了郑州人民医院54例原位肺腺癌和120例微浸润肺腺癌组织中EGFR基因的突变情况，并收集相关临床资料，回顾性研究了早期肺腺癌中EGFR基因突变的特点及其与临床病理特征的关系，现将研究结果总结如下。

资料与方法

1、临床资料

选择2019年1月至2020年12月郑州人民医院收治的54例原位肺腺癌患者和120例微浸润肺腺癌患者作为研究对象，其中男性54例，女性120例，年龄25～79岁，平均年龄53.8岁，年龄≥60岁患者72例，年龄＜60岁患者102例。所有患者的原发病灶均有病理诊断结果支持和完整的胸部影像学资料，且均未接受放化疗。本研究已经通过郑州人民医院伦理委员会的批准，入组患者均知情、同意，入组均为自愿，并按照要求在知情同意书上签字。

2、纳入与排除标准［9-11］

（1）纳入标准：①对入选病例给予临床诊断及病理学检查，诊断结果与国际非小细胞肺癌（NSCLC）临床诊断标准相符；②病历资料完整；③患者具有较好依从性，能够接受定期随访［12］。（2）排除标准：①伴随严重器官疾病以及肝肾功能不全者；②认知功能障碍及智力障碍患者；③临床资料不全者；④肺外存在原发性肿瘤患者；⑤存在严重感染及有心脏病史患者；⑥胃溃疡患者；⑦存在药物过敏史患者；⑧妊娠期及哺乳期妇女。

3、方法

3.1、病理类型诊断所有患者均做过外科手术，术后组织送病理科以明确病理类型。参照2015世界卫生组织（WHO）病理分类系统进行病理分型诊断［13］，由2位高年资病理医师对每例标本的病理诊断进行复核，并确定需要进行分子检测的标本中肿瘤百分比≥10%。

3.2、标本采集与DNA提取切片前后用75%乙醇消毒蜡块、刀片前后、刀片座及镊子，防止交叉污染；切片厚度5µm，数量5～10张，装入1.5 ml EP管中。DNA提取：采用AmoyDx-FFPE DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行DNA提取，测定DNA的浓度和纯度，浓度≥2 ng/µl，纯度为1.8≤A260/A280≤2.0视为合格。

3.3、扩增阻滞突变系统-聚合酶链反应（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）方法检测EGFR基因突变严格按照厦门艾德人类EGFR基因突变检测试剂盒说明书进行操作，将提取好的DNA稀释至2 ng/µl，将42.3µl稀释过的DNA和2.7µl Taq酶混合，分别取5.0µl加入到已经预先分装好反应液的8联管中，瞬时离心，用ABI7500荧光定量PCR仪进行检测，反应条件为：第一阶段，95℃预变性5 min，1个循环；第二阶段，95℃25 s，64℃20 s，72℃20 s，共15个循环；第三阶段，93℃25 s，60℃35 s，72℃20 s，共31个循环。在第三阶段60℃时收集FAM和VIC信号，执行实时PCR，按照判读标准判读结果。检测结果由2位专业人员判读，如果判读结果不一致，再由第3位人员分析做出最终的决定。

4、统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，EGFR基因的突变率与临床病理特征的关系采用χ2检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1、早期肺腺癌组织中EGFR基因的突变率

174例早期肺腺癌组织中有102例出现了EGFR基因突变，总体突变率为58.6%，其中18外显子突变5例，占4.9%；19外显子突变28例，占27.5%；20外显子突变3例，占2.9%；21外显子突变66例，占64.7%。3例20外显子的突变中1例为插入突变，2例为S768I错义突变；T790M在174例组织中均未被检出；外显子21的突变率较高，且全部为L858R错义突变，见表1。

表1 174例早期肺腺癌组织中EGFR基因突变分析

2、EGFR基因突变情况与患者临床病理特征的关系

EGFR基因的突变率在174例早期肺腺癌患者中的特点为：女性患者（77/120，64.2%）高于男性患者（25/54，46.3%），无吸烟史患者（77/119，64.7%）高于有吸烟史患者（25/55，45.5%），微浸润肺腺癌（78/120，65.0%）高于原位肺腺癌（24/54，44.4%），纯磨玻璃病灶（67/112，59.8%）和混杂磨玻璃病灶（33/52，63.5%）高于实性病灶（2/10，20.0%），肿物长径≥1 cm的患者（60/78，76.9%）高于肿物长径＜1 cm的患者（42/96，43.8%），差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与患者年龄无显著关系（P＞0.05）。见表2。

表2 174例早期肺腺癌患者的EGFR基因的突变情况与临床病理特征的关系[例（%）]

讨 论

EGFR基因位于人类7号染色体的短臂上，长度为188 307 bp，共有28个外显子，它编码的EGFR蛋白是一种跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸激酶家族中重要的一员。EGFR活化后可以激活下游多条信号转导通路，调节转录因子继而激活多个基因的转录，参与指导细胞的迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。EGFR基因的突变主要发生在外显子18～21上，它们会引起EGFR下游的信号转导通路出现异常，可导致多种肿瘤发生［14］。在肺腺癌细胞中，EGFR基因的突变可使酪氨酸激酶的活性明显增加，从而导致肺腺癌细胞出现很多异常的生物学行为，在肺腺癌的发生发展过程中起着至关重要的作用［15-16］。因此，检测早期肺腺癌组织中EGFR基因的突变情况，不仅可以给EGFR基因突变导致肺腺癌发生发展的机制提供直接证据，同时也为EGFR靶向治疗是否可以加入到早期肺腺癌术后辅助治疗提供一定的理论依据。

本研究检测了174例早期肺腺癌（54例原位肺腺癌和120例微浸润肺腺癌）组织中EGFR基因的突变情况，其中有102例出现了EGFR基因突变，总体突变率为58.6%，与赵静等［17］报道的早期肺腺癌中EGFR基因的突变率（62.5%）接近。其中18、19、20、21外显子的突变分别占4.9%、27.5%、3.0%、64.7%，突变位点主要集中在19-Del和L858R，与同类研究结果一致［18-20］。值得注意的是，4个外显子中，检出的全部是敏感突变，以21外显子L858R位点突变率最高，这是因为EGFR基因突变类型在中国各地区之间存在显著差异［21］，还是说明L858R突变在早期肺腺癌的发生发展过程中起着特别重要的作用，尚需进一步研究。此外，本研究中174例标本中均未检出T790M突变，从另一方面也印证了T790M突变与EGFR靶向治疗耐药有关，通常在靶向治疗后才出现。

通过分析EGFR基因突变与临床病理特征的关系，我们发现女性患者中的突变率（64.2%）高于男性患者（46.3%）；无吸烟史患者的突变率（64.7%）高于有吸烟史患者（45.5%），年龄与EGFR基因的突变率无明显相关性，这些与肺腺癌的同类研究结果一致［22-23］。

2015年世界卫生组织（WHO）病理分类系统将肺腺癌分为非典型腺瘤样增生、原位腺癌、微浸润腺癌以及贴壁样生长为主的浸润性腺癌［13］。本研究重点分析了原位肺腺癌与微浸润肺腺癌中EGFR基因突变率的差别，发现微浸润肺腺癌患者突变率为65.0%，高于原位肺腺癌患者（44.4%）。这说明在原位癌时期就已经发生了EGFR基因的突变，且随着肿瘤细胞浸润性的增加，EGFR基因的突变率明显增加，这与赵静等［17］的报道结论一致。但是，本研究只分析了原位和微浸润肺腺癌中EGFR基因的突变情况，在肺腺癌的4个阶段中，EGFR基因的突变率有何规律，是否是递增的，不同阶段EGFR基因的突变位点是否一致，这些问题尚需收集更全面的病理类型标本、更多大样本研究的数据来解答。

174例早期肺腺癌中，我们发现纯磨玻璃病灶（59.8%）和混杂磨玻璃病灶（63.5%）中EGFR基因的突变率高于实性病灶（20.0%），与纯磨玻璃病灶相比，混杂磨玻璃病灶组织中的EGFR基因的突变率较高，但两者的差异无统计学意义，这与日本学者Usuda等［24］和国内学者王丹云等［25］的研究结果一致。肿物长径≥1 cm的患者中突变率为76.9%，高于肿物长径＜1 cm的患者（43.8%），表明患者的病灶越大，EGFR基因的突变率越高，这与Sun等［26］的研究结果相似。近年来，早期肺腺癌的影像学特征受到很多关注，以后我们也会持续关注早期肺腺癌的更多影像学特征与病理分型及EGFR等驱动基因之间的关系。

本研究尚存在一定的局限性：首先，本研究采用ARMS-PCR方法，只能检测试剂盒中包含的有限的常见的突变位点，无法检测一些罕见突变位点，会造成数据一定程度的缺失；其次，本研究只检测了早期肺腺癌组织中EGFR基因的突变情况，对于肺腺癌的其他驱动基因的状态无从知晓；再次，本研究纳入的病例数相对较少，且不是很均衡，纳入的病理类型不是很全面，这在一定程度影响了分析结果的稳定性和结论的可信性，我们的结论还需更大样本人群的研究数据做进一步验证。以后我们会继续收集各阶段肺腺癌的病例，尤其是非典型腺瘤样增生和原位肺腺癌，并结合浸润性肺腺癌，采用测序方法检测分析肺腺癌相关的更多驱动基因的状态，以求揭示这些驱动基因在肺腺癌的发生发展过程中的状态及其可能起到的作用。

综上所述，我们发现在早期肺腺癌中EGFR基因突变常见于女性、无吸烟史、微浸润肺腺癌、磨玻璃病灶、肿物长径≥1 cm的患者，以21号外显子L858R突变为主。EGFR基因突变在早期肺腺癌的发生发展过程中扮演着非常重要的角色。因此，检测早期肺腺癌组织中EGFR基因的突变情况，不仅可以给EGFR基因突变导致肺腺癌发生发展的机制提供直接证据，同时也为早期肺腺癌术后的患者是否采用EGFR靶向治疗提供一定的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突