Ku70高表达促进人卵巢癌细胞系的增值并与卵巢癌患者不良预后相关

王 娟，张晓燕，朱爱华，于宏波，范新丹，汤春辉，姚秀芳

(1.南通大学附属妇幼保健院 妇产科，江苏 南通 226001； 南通大学附属如东医院 2.妇产科； 4.病理科，江苏 南通 226400；3.南通大学附属医院 妇产科，江苏 南通 226001)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)被认为是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，其病死率居首位。尽管临床上常采用手术联合化学药物治疗、放射治疗等多种治疗手段，但患者总的5年生存率仍较低[1]。因此，需要寻找一种潜在的、特殊的分子，以便为未来开发一种更有效的检测及治疗方法显得尤为重要。

DNA损伤可引起细胞异常增殖、分化和凋亡，最终导致癌变。DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSB)是最严重的一种DNA损伤类型，它可以被DNA DSB修复系统修复，非同源端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)是人类主要的DNA DSB修复系统[2]，而Ku70/XRCC6是此途径所必需的[3]。Ku70参与了多个核过程，包括DNA修复、端粒维护和细胞凋亡[4]。有报道Ku70也位于细胞质中，调控抗凋亡Bcl-2家族成员。近年来，有研究表明Ku70与肿瘤进展有关，如宫颈癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[4]、肝癌[7]等。

本研究通过检测Ku70在人卵巢癌组织及细胞中的表达，观察卵巢癌细胞的增殖、凋亡及迁移，探讨Ku70在卵巢癌发生发展中的意义。旨在为卵巢癌寻找新的标志物和分子治疗靶点提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本：对2004—2009年在南通大学附属医院治疗的119例EOC手术标本(包括61例浆液腺癌、5例黏液癌、10例子宫内膜样腺癌、10例透明细胞癌和33例其他类型癌)进行免疫组化。从南通大学附属医院病理科档案中收集119例标本资料，并追踪其5年生存率的结果。12个新鲜标本在手术取出后立即用液氮冷冻，-80℃保存，用于Western blot分析，其中包括3例正常新鲜组织和9例EOC组织。所有标本的收取均经南通大学附属如东医院伦理委员会审查批准(NO.20190062)。

1.1.2 细胞系：人卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、OVCAR3、HO8910(上海细胞生物学研究所)。

1.1.3 试剂：小鼠抗人Ku70单克隆抗体、小鼠抗人Ki-67单克隆抗体、小鼠抗人cyclin D1单克隆抗体、小鼠抗人PCNA单克隆抗体、小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、小鼠抗人Bax单克隆抗体和兔抗人GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)；HRP 标记抗兔 IgG(Sigma-Aldrich公司)；CCK-8试剂(Dojindo, Kumamoto公司); Ku70-siRNA及其阴性对照control-siRNA(GenePharma公司)。所有siRNA序列如下:Ku70-siRNA#1(5′-GUGAUG UCCAAUUCAAGAUTT-3′)；Ku70-siRNA#2(5′-GC AUCUUCCUUGACUUGAUTT-3′)；Ku70-siRNA#3(5′-CUGUGGGCAUUUAUAAUCUTT-3′)；Control-siRNA(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及处理：所有细胞在1640培养基中增殖，培养基中添加10%热灭活胎牛血清，37 ℃，5% CO2培养箱中培养。细胞转染：HO8910细胞在培养皿中培养，汇合度达到80%时，根据脂质体转染试剂盒提供的说明书，通过脂质体转染将Ku70-siRNA和control-siRNA导入HO8910细胞系。在无血清的培养基中培养 6 h，然后换成 10%的完全培养基培养 48 h，收集细胞进行Western blot、CCK-8、集落形成、划痕实验、Transwell迁移和凋亡染色的流式细胞仪检测。

1.2.2 Western blot检测蛋白：样本组织加入蛋白裂解液，提取组织蛋白，按比例配制待测样品，进行 SDS-PAGE，将蛋白转至 PVDF(polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜)膜上，在含5%脱脂奶粉的 TBST(tris buffered saline tween，含吐温的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液)中室温封闭 2 h，加一抗(兔抗人Ku70多克隆抗体，1∶400)室温孵育 2 h或4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗室温孵育 2 h，然后用TBST冲洗3次，每次15 min。这些条带由增强化学发光检测系统(Pierce, Rockford, IL)显示。使用ImageJ分析系统测量条带强度。

1.2.3 免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测蛋白表达：手术切除的组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，在玻片上制备4 μm厚的标本切片。切片在二甲苯中常规脱蜡，通过分级乙醇系列再水化，然后在10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)中用高压灭菌器加热到121 ℃ 3 min进行抗原回收。H2O2(0.3%)冷却20 min后，内源性过氧化物酶活性被阻断。PBS(pH=7.2)冲洗后，用小鼠抗人Ku70抗体(1∶400稀释)和小鼠抗人Ki-67抗体(1∶500稀释)室温孵育3 h。所有玻片均采用过氧化物酶-抗过氧化物酶法处理。PBS洗涤后，用显色剂二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)(0.1%磷酸盐缓冲液，0.02 %二氨基联苯胺四盐酸盐和3% H2O2)孵育切片，观察过氧化物酶反应。切片用水冲洗后，用苏木精进行反染色。然后用分级酒精脱水。结果由两位研究员采用双盲法使用徕卡荧光显微镜独立阅片。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖：将转染细胞以2×104cells/well(体积为100 μL)接种到96孔细胞培养板(Corning Inc, Corning NY, USA)中，孵育24 h。然后每孔加10 μL CCK-8试剂，37 ℃的暗室中孵育1.5 h。根据厂家的技术说明，在测试波长为450 nm和参考波长为630 nm的情况下，使用微孔板阅读器(Bio-Rad)测量吸光度值。

1.2.5 集落形成实验检测细胞增殖：将转染了Ku70-siRNA#1和control-siRNA 的HO8910细胞的单细胞悬液(约50个细胞)接种于培养皿中，14 d后集落用0.5%结晶紫染色30 min。对样本进行拍照，并统计可见集落的数量。

1.2.6 流式细胞测量术分析细胞凋亡：转染Ku70-siRNA#1和对照control-siRNA的HO8910细胞培养48 h后收集。在每根试管中加入60 μL的悬浮细胞，然后在每根试管中加入60 μL的检测试剂。在室温下黑暗孵育20 min后，根据试剂盒提供的说明书，使用MuseTM细胞分析仪进行凋亡检测。

1.2.7 免疫共沉淀实验检测蛋白间相互作用：收集HO8910细胞并在缓冲液(50 mmol/L, Tris-HCl, pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/lL EDTA, 1% NP-40, 0.5%去氧胆酸，0.1% SDS)中裂解。收集上清30 μL作为Input。剩下的液体用30 μL protein A/G agarose在4 ℃中预处理 2 h。之后,预处理的上清液分离成两部分，分别加入6 μL鼠单克隆抗体Ku70和0.3 μL老鼠免疫球蛋白IgG在4 ℃中低速孵化过夜。然后加入30 μL protein A/G在4 ℃中低速孵育2 h，去除上清液，收集沉积物，然后使用针对Ku70和Bax的特异性抗体对免疫复合物进行免疫印迹分析。

1.2.8 免疫荧光检测基因表达：将转染了Ku70-siRNA和control-siRNA的HO8910细胞接种到培养皿中，加入含有10%灭活胎牛血清的1640培养基，放置在37 ℃，5% CO2培养箱中孵育过夜。然后用PBS洗涤，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞30 min，用PBS洗涤3次，然后用0.2% Tritonx-3%牛血清白蛋白-PBS渗透10 min。用0.1% BSA缓冲液在室温下封闭2 h，然后在室温下用Ku70抗体孵育2 h，PBS洗涤后，用二抗孵育细胞，用hochest进行反染色，并用荧光显微镜(Leica CTR 5000)观察。

1.2.9 划痕实验检测细胞迁移能力：细胞在6孔板的单层细胞中几乎完全汇合。转染48 h后，血清饥饿细胞12 h。然后用10 μL的移液管尖端在满细胞的6孔培养板中间做划痕，用PBS洗涤脱落的细胞，加入含有1%胎牛血清的1640培养基，放入37 ℃，含有5% CO2培养箱中培养，用20×物镜的相差显微镜拍摄0 h和24 h时的细胞状态。

1.2.10 Transwell小室法检测细胞侵袭：经Ku70-siRNA#1和control-siRNA预处理的细胞经胰蛋白酶处理后重悬于不含血清白蛋白的1640培养基中。将细胞(约1×105个/孔)添加到24孔趋化板Transwell小室 (Corning，孔径8 μm)的顶部腔室中，并在底部腔室中添加含有10% FBS的1640培养基。孵育24 h后，去除顶部(未迁移)细胞，底部(迁移)细胞用4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色可见细胞。在200倍显微镜下统计5个区域的迁移细胞数量，并测定每个腔室的平均值。所有实验都是重复进行的。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Ku70在上皮性卵巢癌组织和细胞中过表达。

Ku70在肿瘤组织的表达水平高于正常组织(图1A～B)。Ku70在4株卵巢癌细胞系中高表达，其中在HO8910细胞中表达最显著(图1C)。与对照组相比，转染siRNA后HO8910细胞中Ku70的表达被抑制，其中Ku70-siRNA#1的下调效果最明显，可用于后续实验(图1D)。Ku70在119例上皮性卵巢癌样本中的表达情况，与预期一致，Ku70在分化差的标本中表达高于分化好的标本，这与Ki-67一致(图2)。

图1 Ku70在EOC组织和HO8910细胞中的表达情况Fig 1 Expression of Ku70 in EOC tissues and HO8910 n=3)

图2 免疫组化分析Ku70、Ki-67在119例EOC组织中的表达及分布

在上皮性卵巢癌患者组织样本,Ku70高表达与肿瘤分期(P<0.001),肿瘤分级(P<0.05),有无淋巴结转移(P<0.05)及有无远处转移(P<0.05)密切相关(表1)。此外，Ku70的表达与Ki-67的增殖活性也呈正相关(r=0.642,P<0.001)(图3)。

表1 Ku70和Ki-67在119例EOC样本中的表达 及临床病理特征

图3 Ku70与Ki-67增殖指数在EOC中表达的相关性Fig 3 Relationship between Ku70 and Ki-67 prolifera- tion index expression in EOC

2.2 Ku70表达与上皮性卵巢癌患者生存率的关系

Ku70高表达的患者其5年生存率低，年龄(P<0.05)，肿瘤分级(P<0.05)， 肿瘤分级(P<0.001)，组织学类型(P<0.05)，远处转移(P<0.001)，Ku70表达(P<0.001)，Ki-67表达(P<0.001)与其5年生存率密切相关。Cox比例风险模型进行多因素分析临床病理特征的独立预后价值，患者的5年生存率与患者年龄(P<0.001)，肿瘤分级(P<0.05)，Ki-67(P<0.05)及 Ku70 的表达 (P<0.05)密切相关，Ku70的表达可以作为评估卵巢癌患者5年生存率的一个独立因素(图4，表2)。

图4 根据Ku70蛋白表达情况绘制119例EOC患者 Kaplan-Meier生存曲线Fig 4 Kaplan-Meier survival curves for 119 EOC patients according to Ku70 protein expression status(long-rank test)

表2 单因素和Cox回归分析119 EOC样本中各种病理因素对生存率的影响

2.3 低表达Ku70可抑制上皮性卵巢癌细胞增殖

与对照组相比，转染了Ku70-siRNA#1及Ku70-siRNA#2的HO8910细胞增殖被抑制(图5A)。转染Ku70-siRNA#1及Ku70-siRNA#2后，HO8910细胞形成的集落数量和大小均显著减少(图5C,D)。此外，Ku70-siRNA #1及Ku70-siRNA#2转染的细胞中Ku70的表达显著降低，与PCNA、cyclin D1的下调一致(图5B)。

A.down-regulating Ku70 inhibited cell proliferation by CCK-8 assay; B.down-expressed Ku70 inhibited the expression of cell-cycle-related proteins like cyclin D1 and PCNA; C,D.inhibition of Ku70 expression could inhibit the proliferation of HO8910 cells by colony formation assay; *P<0.05 compared with control-siDNA

2.4 Ku70表达缺失诱导卵巢肿瘤细胞凋亡

与control-siRNA转染细胞相比，Ku70-siRNA#1转染细胞的凋亡百分率显著升高(图6A)。Ku70参与了Bax (Bcl-2家族之一)凋亡通路，这与研究结果一致(图6B,C)。免疫荧光分析证实Ku70确实位于细胞质和细胞核中(图6D)。

A.inhibiting Ku70 promotes apoptosis of HO8910 cells by flow cytometry; B.Western blot was used to detect the protein levels of Bcl-2 and Bax when inhibiting Ku70 compase with control; C.interaction of Ku70 and Bax was demonstrated by co-immunoprecipitation assay; D.blue nucleus, green cytomembrane located by immunofluorescence(×200)

2.5 下调Ku70表达可减缓卵巢肿瘤细胞的迁移

Ku70的下调表达可以通过使被划伤HO8910细胞的“伤口”更慢地愈合，从而减少伤口愈合过程(图7A)。同时，在Transwell 小室实验中，与对照组相比，Ku70的下调表达抑制了细胞向底腔的迁移(图7B)。

A.effect of Ku70 knockout on the migration of HO8910 cells by wound healing assays(×40); B.Transwell assays were used to detect the effect of Ku70 knockout on the migration of HO8910 cells(×200); *P<0.05 compared with control

3 讨论

上皮性卵巢癌(EOC)被认为是最致命的妇科肿瘤之一，虽然临床采用手术、化学治疗和放射治疗等综合治疗手段，但其在妇科恶性肿瘤中病死率仍最高[1]。此外，EOC具有高复发率和多药耐药性，患者5年生存率低[8]。因此，更好地了解EOC的分子机制有助于靶向化疗药物的研发。

NHEJ被认为是哺乳动物细胞中主要的DNA修复途径，而Ku70是参与NHEJ的主要因子。Ku70的失调使细胞对DNA损伤敏感，突变和染色体畸变的积累导致细胞凋亡和过度细胞增殖，增强基因组不稳定引发肿瘤[2,9]。研究表明，Ku70与细胞增殖、凋亡和迁移有关[7,10-11]。本研究通过集落形成、CCK-8、PCNA、cyclin D1检测，初步提示Ku70下调表达可能通过细胞周期过程降低EOC细胞增殖。此外，流式细胞仪分析显示， 降低Ku70的表达可能促进EOC细胞凋亡。通过划痕实验和Transwell小孔实验测定Ku70诱导细胞迁移的能力。以上结果提示，Ku70的过表达可能在卵巢癌的发生发展中起重要作用。

一些研究证实，Ku70也位于细胞质中，通过隔离癌组织线粒体中的Bax来抑制细胞凋亡，而当Ku70从Bax释放时，Bax可以转运到线粒体中，触发细胞色素C的释放，导致caspase依赖的细胞凋亡[4]。本研究中，免疫组化和免疫荧光显示Ku70位于EOC细胞的细胞核和细胞质中，这与报道[12]一致。流式细胞测量术分析显示，下调Ku70可诱导EOC细胞凋亡。Western blot显示，在Ku70-siRNA#1转染的细胞中，促凋亡的Bax表达增加，抗凋亡的Bcl-2表达减少。免疫共沉淀显示Ku70与Bax在EOC中相互作用。以上结果提示，Ku70可能是EOC中Bax凋亡通路抑制细胞凋亡的重要原因。

综上所述，抑制Ku70表达可延缓EOC细胞增殖，诱导细胞凋亡，减少细胞转移。Ku70可能通过参与NHEJ的DSB修复机制，调控细胞周期及caspase依赖的细胞途径发挥作用。Ku70可能是卵巢癌等肿瘤的重要治疗靶点。