苦参碱减轻百草枯诱导的模型小鼠肺纤维化

李美崎，邓 俊，王宋平

(西南医科大学附属医院 呼吸与危重症医学科， 四川 泸州 646000)

百草枯(paraquat,PQ)是一种非选择性除草剂，对人体具有极强的毒性，进入人体后，可引起多器官损伤，尤其是其可导致肺纤维化，病死率极高[1]。研究报道上皮细胞间充质转化(epithelial-mesen-chymal transition，EMT)的异常激活在肺纤维化过程中起重要作用，促进胶原纤维的分泌和细胞外基质的沉积，最终导致肺纤维化[2]。苦参碱(matrine)是一种天然的生物碱，提取于传统中草药苦参，具有多种生物活性，对呼吸系统具有平喘、抗急性肺损伤、抗纤维化作用等[3]。虽然有研究报道称，苦参碱能够发挥抗纤维化作用，但苦参碱对百草枯所致肺纤维化是否也具有保护作用及其可能的作用机制尚不清楚，还有待进一步研究。因此，本研究通过腹腔注射百草枯以诱导小鼠肺纤维化模型，探讨苦参碱对百草枯诱导的模型小鼠肺纤维化的保护作用及其可能的作用机制，为其在临床中运用提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物：SPF级雌性BALB/C小鼠24只，6周龄，体质量17～19 g[湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号：SCXK(湘)2019-0004]，在温度为23 ℃，湿度为40%～65%，12 h昼夜交替的封闭室内条件下适应性喂养2周，可自由进食及饮水。

1.1.2 主要试剂：百草枯(北京百灵威科技有限公司)；苦参碱(上海麦克林生化科技有限公司，纯度：98%)；羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)试剂盒(南京建成科技有限公司)；BSA(牛血清白蛋白)(Roche生物科技公司)；BCA蛋白质浓度测定试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液(ASPEN科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：将小鼠随机分为对照组(control)、百草枯(PQ)组和苦参碱(matrine)组，每组8只。一次性腹腔注射百草枯(18 mg/kg)以诱导肺纤维化并建立模型。建立模型24 h后，matrine组每天予以苦参碱(100 mg/kg)灌胃进行干预治疗，持续27 d。

1.2.2 HE染色观察肺组织病理改变：将整个右肺组织用0.9%氯化钠溶液充分冲洗，4%多聚甲醛室温固定24 h以上，经75%无水乙醇梯度脱水，石蜡包埋，室温冷却后制成4 μm厚度切片，进行HE染色，在光镜下观察并拍照分析。

1.2.3 Masson染色及Ashcroft评分观察肺组织胶原沉积：将肺组织进行固定、脱水、石蜡包埋、切片，进行Masson染色，在光学显微镜下观察肺组织胶原沉积情况，并拍照分析。参照文献[4]，采用Ashcroft评分以评估肺组织纤维化程度，评分标准为：0级，正常肺组织；1级，肺泡或细支气管壁微小纤维增厚；2～3级，肺泡壁中度增厚，肺组织结构无明显损害；4～5级，纤维化加重，肺结构明显受损，形成纤维带或小纤维团块；6～7级，肺组织结构严重破坏，纤维面积大，可伴有蜂窝肺形成；8级，满视野纤维组织，整个肺组织全部闭塞坏死。

1.2.4 羟脯氨酸含量的检测：称取30 mg小鼠左肺肺组织，碾碎置于试管中，加入1 mL水解液并混匀，沸水浴充分水解20 min，NaOH调pH值至6.0～6.8左右，加入双蒸水至10 mL，加入适量活性炭，混匀离心，取1 mL上清于波长550 nm处，1 cm光径，测定各管吸光度值，并计算肺组织羟脯氨酸含量。

1.2.5 Western blot检测胶原蛋白含量：提取肺组织总蛋白，使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，电泳分离，将分离的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，封闭液室温封闭1 h,加入一抗稀释液(collagen Ⅰ、collagen Ⅲ，1∶500)4 ℃孵育过夜，通过TBST缓冲液清洗PVDF膜3次，加入山羊抗兔二抗(1∶10 000)室温孵育30 min，采用化学发光剂(ECL)显影，并分析目标带吸光度值。

1.2.6 免疫荧光检测EMT相关蛋白表达：取包埋好的石蜡切片，放入5%牛血清白蛋白(BSA)中封闭20 min。封闭后分别加入一抗(鼠抗 anti-α-SMA，1∶500，鼠抗 anti-E-cardherin，1∶1 000，鼠抗 anti-vimentin,1∶200)4 ℃孵育过夜,充分洗涤后，加入相应种属比例的二抗(1∶50)，37 ℃孵育50 min,再用PBS洗涤3次，最后DAPI避光复染细胞核5 min，封片后在荧光显微镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

对照组小鼠精神状态良好，进食、饮水正常，体质量稳定增加；PQ组小鼠精神萎靡，呼吸急促，活动减少，易抓捕，进食、饮水减少，体质量下降；matrine组小鼠较模型组小鼠症状有所改善。

2.2 HE染色

对照组小鼠肺组织结构正常，未见明显形态学改变；PQ组小鼠肺组织结构明显破坏，部分肺泡塌陷，大量炎性细胞浸润；而matrine组小鼠肺组织炎性细胞浸润及肺组织结构破坏程度较模型组小鼠有所减轻(图1)。

图1 各组小鼠肺组织结构对比(HE染色)Fig 1 Comparison of lung tissue of mice in each group(HE staining,×400)

2.3 Masson染色

对照组小鼠未见明显胶原沉积现象；PQ组小鼠肺泡形态改变，可见蓝色胶原纤维沉积，而matrine组小鼠肺组织也可见胶原纤维沉积，但较PQ组得到改善(图2)。

图2 各组小鼠肺组织对比(Masson染色)Fig 2 Comparison of lung tissue of mice in each group(Masson staining,×400)

2.4 Ashcroft评分

与对照组比较，PQ组小鼠Ashcroft评分明显升高(P<0.001)，与PQ组比较，经matrine治疗后，Ashcroft评分有所下降(P<0.001)(表1)。

表1 各组小鼠肺组织Ashcroft评分比较

2.5 羟脯氨酸含量的比较

与对照组比较，PQ组肺组织羟脯氨酸含量增高(P<0.001)，与PQ组小鼠比较，matrine治疗后可降低肺组织羟脯氨酸的含量(P<0.001)(图3)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group图3 各组小鼠羟脯氨酸含量对比Fig 3 Comparison of hydroxyproline content in lung tissue of each

2.6 肺组织纤维胶原蛋白相关蛋白表达的比较

与对照组小鼠肺组织中collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表达比较，PQ组肺组织中collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表达升高(P<0.001)；而matrine组小鼠肺组织中collagenⅠ、collagenⅢ蛋白表达较PQ组有所降低(P<0.001)(图4)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group图4 Western blot检测各组小鼠肺组织collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表达

2.7 肺组织EMT相关蛋白表达的比较

与对照组比较，PQ造模后小鼠肺组织中上皮性钙黏附蛋白(E-cardherin)含量降低(P<0.001)，而α-平滑肌蛋白(α-SAM)和波形蛋白(vimentin)含量升高(P<0.001)，matrine组小鼠与PQ组相比，E-cardherin蛋白含量升高(P<0.001)，而α-SAM和vimentin蛋白含量降低(P<0.05，P<0.001)(图5)。

Blue represented the nucleus and red was the target protein：E-cardherin, α-SMA and vimentin proteins(×400); *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group

3 讨论

百草枯(PQ)是一种速效、非选择性的除草剂，因其具有价格低廉、低污染等特点，而广泛应用于多数发展中国家[5]。其可通过呼吸道、消化道、皮肤等途径进入人体，对人体具有极大的毒性，高剂量的PQ可导致包括心、肺、肾、肝和脑在内的多个器官衰竭[6]。有研究报道，当PQ进入人体后，肺由于其强大的多胺摄取系统而成为主要的蓄积点，其肺浓度比血浆浓度高6～10倍，因此，肺是PQ病理作用的一个特定靶点[7]。PQ进入人体后，在肺泡上皮细胞中积累，导致肺组织损伤，早期可表现为肺泡充血、水肿、肺泡壁结构破坏以及各种炎性细胞的浸润和渗出，进一步发展为成纤维细胞增生和过度胶原沉积，最后进展为肺纤维化[8]。百草枯中毒所致的肺纤维化目前尚无有效治疗方法，临床上主要使用糖皮质激素、 免疫抑制剂、 抗氧化治疗等， 但治疗效果不佳，病死率极高[9]。因此开发有效的药物治疗肺纤维化是必要的。

苦参碱是中草药苦参中含量最高的生物碱，具有广泛的生物作用，据报道，苦参碱对人类上皮细胞相关疾病具有潜在的治疗功效[10]，已有相关研究报道，苦参碱能够通过抑制JAK-STAT信号传导途径发挥抗博来霉素所诱导的肺纤维化作用[11]。而博来霉素和百草枯所诱导的肺纤维化在表型上相似，但两者基因调控方式及数量是不同的[12]。那么，苦参碱是否可以减轻百草枯所诱导的肺纤维化，还有待进一步研究。

肺纤维化的主要特征是正常肺组织结构的破坏、成纤维细胞的活化及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的沉积[13]。在肺纤维化中，细胞外基质的主要成分为I型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白，羟脯氨酸是一种非蛋白原性、非必需的氨基酸，是胶原蛋白的主要成分，对胶原蛋白的合成和稳定起着关键作用，因此，羟脯氨酸是反映胶原沉积程度的重要标志物[14]。本实验发现与对照组比较，模型组的羟脯氨酸、胶原蛋白Ⅰ及胶原蛋白Ⅲ含量明显升高，而予以苦参碱干预后，上述指标含量有所下降，病理学观察发现肺纤维化程度有所减轻。说明，苦参碱可降低百草枯诱导的肺纤维化小鼠肺组织胶原蛋白的合成与积累。

研究表明，EMT是纤维细胞最重要的来源之一，Ⅱ型肺泡上皮细胞通过EMT获得成纤维细胞表型后，产生大量的细胞外基质，促进肺纤维化的发展[15]。EMT的典型特征是极性丧失、细胞骨架重组、上皮形态和标志物(包括E-cadherin和occludens-1)的丧失，以及间充质形态和标志物(如α-SMA、vimentin)的获得[16]。本研究发现经苦参碱治疗后，小鼠纤维化肺组织中E-cadherin蛋白的表达有所增加，而α-SMA和vimentin蛋白的表达有所降低，抑制EMT作用，从而减少细胞外基质的沉积。

综上所述，苦参碱可通过抑制EMT作用，从而抑制胶原蛋白的合成和积累，减轻百草枯诱导的肺纤维化作用。本研究为临床应用苦参碱治疗百草枯中毒所致肺纤维化提供了新的参考依据。