他莫昔芬抑制TGF-β/Smad通路减轻人皮肤成纤维细胞病理性增生

史春田，毛姝然，彭译萱，肖志波

(哈尔滨医科大学附属第二医院 整形外科， 黑龙江 哈尔滨 150086)

增生性瘢痕(hyperplastic scar，HS)是一种由异常组织修复过程引起的皮肤纤维化疾病[1]，是皮肤损伤后最常见的并发症，其病因尚不清楚。成纤维细胞的过度增殖分化及细胞外基质沉积是瘢痕形成的典型病理特征。据报道，高达70%的患者在烧伤后出现HS, 40%～70%的患者术后出现HS[2]。

皮肤纤维化的发病率与性别显著相关，总体比例(女性:男性)约为6∶1，在生育期间达到10∶1[3-4]。虽然皮肤纤维化在女性中更常见，但来自欧洲硬皮病试验和研究(EUSTAR)组的数据显示，男性皮肤纤维化表现出更严重的表型，且预后更差[3]。且证实Balb/C、C57BL/6和DBA/2雄性小鼠比雌性小鼠更容易发生明显的纤维化[5]。尽管瘢痕形成过程中存在公认的性别偏倚，但其确切作用及相关分子基础仍然知之甚少。特别是性激素在调节瘢痕形成中的作用尚未明确。有研究表明，雌激素诱导成纤维细胞功能障碍，并增加细胞外基质蛋白的产生，而其他一些研究报道，雌激素治疗后胶原蛋白的产生减少[6-7]。因此，更详细探讨干扰性激素在真皮纤维化发病机制中的作用具有重要意义。鉴于他莫昔芬是一种雌激素受体调节剂，评估他莫昔芬对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的真皮成纤维细胞的病理性增生的影响，具有潜在临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

免疫细胞化学试剂盒，PV-9000(ZSGB-BIO公司)；TGF-β1(R&D公司)；他莫昔芬(Selleck公司)；反转录试剂PrimeScript RT Master Mix、Ex Taq(TaKaRa公司)；α-SMA抗体(Sigma-Aldrich公司)；MTS试剂盒(Promege公司)；Bradford Protein Assay试剂盒(Bio-Rad公司)；Trizol试剂、荧光标记二抗(Invitrogen公司)；Alexa Flour594、DAPI、Fibronectin和α-SMA抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 人皮肤成纤维细胞的分离和培养:无菌条件下采集人皮肤成纤维细胞标本(来自于哈尔滨医科大学附属第二医院)，浸于含5%链霉素的PBS中。用无菌剪刀剪至真皮层，将组织切成1 cm×1 cm×1 cm大小，均匀放入75 cm2培养皿中。加入含有10%胎牛血清和1%链霉素-青霉素的DMEM培养基中，直至组织牢固附着于皿底(4～6 h)，然后在37 ℃、5% CO2的空气中培养。每3 d换一次培养基，细胞汇合达到90%时用0.25%胰蛋白酶使细胞传代。3～7代细胞用于实验。

所有患者已签署知情同意书，本研究经哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会批准实施(伦理审查批准号：KY2021-320)。

1.2.2 成纤维细胞鉴定:Vimentin免疫细胞化学染色鉴定成纤维细胞(PV-9000法，ZSGB-BIO公司)。具体步骤如下：

即贴壁细胞4 ℃冰丙酮固定 5 min；3% H2O2阻断液 10 min；加兔抗人波形蛋白单克隆抗体一抗，4 ℃孵育过夜；滴加试剂 1(Polymer Helper)，37 ℃恒温箱孵育 20 min；滴加试剂 2 (poly peroxidase-anti rabbit IgG)，37 ℃恒温箱孵育2 h；DAB显色、苏木精液复染，脱水、透明和中性树胶封固。显微镜下观察并拍照，细胞呈棕黄色显色作为阳性表达。

1.2.3 细胞处理及分组:成纤维细胞分为3组，即：对照组、TGF-β1组和TGF-β1+他莫昔芬组。依此将成纤维细胞(2×105个/孔)置于6孔板中，加入新鲜DMEM培养基12 h。对照组细胞不予以药物干预，TGF-β1组在对照组基础上加入10 ng/μL的TGF-β1处理48 h，TGF-β1+他莫昔芬组先用他莫昔芬(10 μmol/L)预处理细胞24 h，后使用TGF-β1(10 ng/μL)处理48 h。

1.2.4 细胞迁移:通过伤口愈合实验检测细胞迁移能力，具体步骤如下：在6孔板中接种等量的细胞。当细胞汇合度达到90%时，用1 mL无菌微管尖端刮取细胞，用PBS温和洗涤3次以清除细胞碎片，然后加入低血清的培养基。划痕后立即用光学显微镜拍照。孵育24 h后再次拍摄。利用Image J软件测量细胞迁移引起的刮伤面积变化，确定创面愈合能力。

1.2.5 定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR):用Trizol reagent (Invitrogen公司)从细胞中提取总RNA，并用PrimeScript RT Master Mix进行反转录。PCR引物序列见表1。采用SYBR预混剂ExTaq Ⅱ及real-time PCR系统进行定量检测。采用2-ΔΔCT法计算相对mRNA表达。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 免疫荧光实验:经过药物处理的细胞用4%多聚甲醛固定10 min， 0.5% Triton X-100室温穿透10 min，5% BSA室温封闭1 h。α-SMA抗体孵育过夜。次日使用山羊抗小鼠的二抗AlexaFluor 594 及DAPI在室温下进行染色。在荧光显微镜下观察。

1.2.7 细胞活力检测:MTS按照说明进行细胞活性分析，将MTS/非那静乙硫酸盐混合试剂共10 μL加入96孔板的每个孔中，37 ℃ CO2培养箱中孵育3 h。使用TECAN GENIOS酶标仪测定490 nm处的吸光度。

1.2.8 免疫印迹:将细胞在预冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤1次，并在含有蛋白酶抑制剂(Roche公司)的裂解缓冲液中收集裂解液，通过高速离心(4 ℃，14 000 g, 10 min)收集上清。用Bradford protein assay 试剂盒测定裂解物的蛋白浓度。从每个样品中提取等量的蛋白质，SDS-PAGE分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。在5%牛奶封闭1 h，一抗孵育4 ℃过夜。次日用荧光标记二抗室温下孵育1 h。抗体结合用增强的化学发光检测系统进行可视化。使用Image J软件计算蛋白相对表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 人成纤维细胞鉴定

免疫细胞化学结果显示(图1)，倒置相差显微镜下细胞 Vimentin 染色呈阳性符合人成纤维细胞特性。

A.×40；B.×100图1 免疫细胞化学鉴定人成纤维细胞Fig 1 Immunocytochemical identification of human- fibroblasts

2.2 他莫昔芬抑制TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞增殖

MTS结果显示(图2)，与对照组相比，TGF-β1可以诱导人皮肤成纤维细胞增殖。与TGF-β1组相比，10 μmol/L的他莫昔芬处理后，成纤维细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。

△P<0.05 compared with the control group,TGF-β1 induced proliferation of skin fibroblasts;*P<0.05 compared with TGF-β1 group, the proliferation ability of fibroblasts was significantly reduced after tamoxifen treatment图2 MTS实验检测细胞在490 nm处的吸光度值Fig 2 Absorbance value of cells at 490 nm detected

2.3 他莫昔芬抑制TGF-β1诱导的皮肤成纤维细胞迁移

伤口愈合实验结果显示，与对照组相比，TGF-β1组皮肤成纤维细胞伤口愈合能力增强(P<0.05)；与TGF-β1组相比，他莫昔芬处理组伤口愈合能力被抑制，细胞迁移能力降低(P<0.05)(图3)。

△P<0.05 compared with the control group, the wound healing ability of skin fibroblasts in TGF-β1 group was enhanced; *P<0.05 compared with TGF-β1 group, wound healing ability was inhibited and cell migration ability was decreased in the tamoxifen treatment group

2.4 他莫昔芬抑制TGF-β1诱导的皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化

免疫荧光染色结果表明，TGF-β1显著促进α-SMA的表达，而他莫昔芬处理后细胞α-SMA表达降低。说明他莫昔芬抑制了TGF-β1诱导的皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化(图4)。

图4 免疫荧光法检测细胞分化Fig 4 Cell differentiation was detected by immunofluorescence assay (×400)

2.5 他莫昔芬抑制TGF-β1诱导的人皮肤纤维化相关基因mRNA的表达

与TGF-β1组相比，他莫昔芬能够显著抑制COL1、COL3、肌成纤维细胞标志物α-SMA的mRNA水平(P<0.05)(图5)。

*P<0.01 compared with the control group, TGF-β1 promoted the mRNA expression levels of COL1, COL3 and α-SMA; #P<0.05 compared with the TGF-β1 group, tamoxifen could significantly inhibit the mRNA expression levels of COL1, COL3 and α-SMA

2.6 他莫昔芬抑制TGF-β1诱导的人皮肤纤维化相关蛋白的表达

Western blot检测皮肤纤维化相关蛋白fibronectin和α-SMA的表达。与 RT-qPCR结果一致，TGF-β1能够促进fibronectin和α-SMA蛋白水平，而他莫昔芬能够显著抑制fibronectin和α-SMA蛋白水平(P<0.05)(图6)。

*P<0.05 compared with the control group, TGF-β1 could promote the levels of fibronectin and α-SMA protein; #P<0.05 compared with TGF-β1 group, tamoxifen could inhibit fibronectin and α-SMA protein levels

2.7 他莫昔芬抑制TGF-β1/Smad信号通路参与瘢痕形成

Western blot结果显示，与对照组相比，TGF-β1组中的TGF-β1、Smad和p-Smad蛋白表达均显著增加(P<0.05)；与TGF-β1组相比，他莫昔芬处理组TGF-β1、Smad和p-Smad蛋白表达均显著抑制(P<0.05)(图7)。

*P<0.05 compared with the control group, the protein expressions of TGF-β1, Smad and P-Smad were increased in TGF-β1 group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group, the protein expressions of TGF-β1, Smad and p-smad were significantly inhibited in tamoxifen treatment group

3 讨论

HS不仅影响皮肤美观，而且妨碍正常肌肉功能，给人们造成许多心理和生理困扰[8]。巨大经济和社会负担提示需对HS形成机制和预防措施进行研究。

激活的肌成纤维细胞是组织纤维化的关键效应细胞[9]。活化成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，产生细胞外基质和蛋白酶，导致炎症条件下正常组织结构的异常破坏，是瘢痕形成的主要病理学过程。伤口过度修复过程中释放的TGF-β是成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的主要驱动因素[10]。因此，识别并阻止TGF-β诱导的肌成纤维细胞形成的因子可能为治疗异常组织重塑提供有新思路。

他莫昔芬是一种合成的选择性雌激素受体(ER)调节剂。最近，由于性激素在瘢痕形成过程中的作用逐渐被发现，关于性激素在皮肤瘢痕发展过程中作用的数据在不同的研究组织中是复杂和矛盾的。他莫昔芬因其抗纤维化特性引起了人们的关注[11-12]，其机制尚不清楚。在本研究中，发现了他莫昔芬抑制TGF-β在人皮肤成纤维细胞中的潜在作用。他莫昔芬能有效抑制TGF-β1驱动的肌成纤维细胞标记蛋白的表达和成纤维细胞的增殖活化以及细胞外基质沉积，可能对病理条件下激活的肌成纤维细胞具有治疗潜力。

许多研究表明他莫昔芬具有抗纤维化特性。他莫昔芬已被证明能抑制肾纤维化[11,13]，腹膜纤维化[14]、肥厚性瘢痕[15]以及硅诱导肺纤维化[12]。在这些研究中，他莫昔芬的作用与受影响组织中TGF-β和其他生长因子的表达下调有关[12,16]。虽然在实验中没有探索其他自分泌生长因子表达的变化，但实验证明，他莫昔芬可以阻止TGF-β诱导的成纤维细胞分化。本实验通过分析磷酸化的Smad2和Smad3表达水平，发现他莫昔芬能够抑制Smad通路的激活。提示除抑制TGF-β1的表达外，他莫昔芬还可以阻断TGF-β/Smad信号通路的活化，从而发挥抑制成纤维细胞过度活化的作用。

此外，肌成纤维细胞除了是组织纤维化的效应细胞外，还与癌发生高度相关[17]。在这种情况下，它们被称为癌症相关的成纤维细胞，并已被证明释放可溶性介质和细胞外基质，为肿瘤生长和转移营造有利的微环境[18-19]。肌成纤维细胞的这一功能是当前研究的重点。他莫昔芬在临床上用于治疗乳腺癌患者[20]。如果他莫昔芬抑制与癌症相关的成纤维细胞的激活，那么还可能具有抗癌益处。因此，莫西芬对其他肿瘤中激活成纤维细胞的潜在作用也值得探索。