USP6基因重排检测在骨与软组织病理诊断中的作用

吴春锋，朱维健，徐 毅，沙晓筱，夏春燕

泛素特异性蛋白酶6(ubiquitin-specific protease6, USP6)又称TRE17或Tre2，是泛素特异性蛋白酶家族中被最早发现的成员之一。Oliveira等[1]发现在原发性动脉瘤样骨囊肿(aneurysmal bone cyst, ABC)中存在CDH11-USP6基因重排，提示USP6基因可能具有潜在的致病性。多项研究发现在原发性ABC、结节性筋膜炎(nodular fasciitis, NF)、骨化性肌炎(myositis ossificans, MO)等疾病中存在USP6基因与多种基因发生重排现象。USP6基因重排在原发性ABC、NF等软组织病变的诊断中具有较好的特异性，能与其他组织学相似的病变进行鉴别[2]。本文回顾性分析42例骨和软组织病变标本，采用FISH法检测USP6基因重排情况，了解其在原发性和继发性ABC、MO及NF等病变中的诊断及鉴别诊断作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年1月～2020年12月海军军医大学第二附属医院骨科送检的骨和软组织标本42例，其中男性22例，女性20例。年龄3～55岁，平均26岁。脊柱病变28例，胫骨病变3例，股骨病变2例，髂骨2例，肱骨1例，髌骨1例，上颌窦1例，右颊1例，手指1例，足趾1例，肩胛1例。1例为穿刺活检标本，41例为手术刮除或切除标本。所有病例均经两位经验丰富的病理学专家重新阅片，按照WHO(2020)骨与软组织肿瘤分类标准进行病理诊断，并进行USP6基因重排检测。

1.2 影像学特征原发性和继发性ABC呈膨胀性溶骨性生长，由充满血液的腔隙组成，血池间有包含骨小梁的纤维组织间隔。其MRI图像改变包括多个大小不等的囊状骨破坏，受累骨呈分叶状膨胀变形，常向软组织膨出，边界为壳状的骨膜骨或无钙化的骨膜，其囊腔内含新鲜或陈旧的血液，常常表现为液液平面。

1.3 标本处理送检组织经10%中性福尔马林固定、徕卡ASP300脱水机脱水浸蜡、常规石蜡包埋、切片。质硬骨组织样本经10%甲酸脱钙液脱钙软化处理。

1.4 免疫组化3～5 μm厚的组织防脱切片行免疫组化MaxVision法染色，H3F3A抗组蛋白H3.3 G34W兔单克隆抗体(克隆号RM263)，H3F3B抗组蛋白H3.3 K36M兔单克隆抗体(克隆号RM193)和羊抗兔鼠通用型二抗试剂盒均购自福州迈新生物公司，阳性均为细胞核着色。

1.5 FISH检测及结果判读USP6基因双色分离探针试剂盒购自广州安必平医药公司。探针位于染色体17p13.2，基因近端(近着丝粒)探针标记红色荧光，基因远端(近端粒)探针标记绿色荧光。

FISH检测严格按照标准化流程操作，具体步骤：3～5 μm厚的组织防脱切片(65±5) ℃烤片2 h，脱蜡、水化，(100±5) ℃去离子水煮片20 min，胃蛋白酶消化15 min，滴加探针，杂交仪中85 ℃变性5 min，37 ℃杂交10～18 h。4’，6-二脒基-2’-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2’-phenylindole，DAPI)进行核复染，荧光显微镜下观察。

结果判读：FISH结果由两位有经验的病理医师独立判读：计数200个不重叠的细胞核，红色信号和绿色信号距离>2个信号点为阳性细胞，阳性细胞比例>5%视为分离重排阳性。

1.6 Sanger测序使用PCR仪扩增H3F3A和H3F3B 2号外显子目的片段，引物由厦门艾德医学检验所合成提供。目的片段扩增反应体系为反应液12.5 μL(dNTPs、Mg2+、Taq酶)，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL，总反应体系25 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，合计40个循环，72 ℃延伸5 min。扩增产物交由厦门艾德医学检验所测序部进行测序，测序结果与基因组DNA序列进行对比，参考序列分别为NM_002107.6和NM_005324.5。

2 结果

经FISH检测，42例中40例见可判读的荧光信号；2例检测不成功，镜下无荧光信号，均为经酸脱钙处理。21例USP6基因断裂重排阳性(1A)，结合病理特征及影像学表现，18例确诊为原发性ABC(图1B)，其中4例为实性ABC(图1C)、2例NF、1例MO。19例USP6基因断裂重排阴性(图2A)，结合影像学表现、病理特征、免疫表型及基因测序结果，其中8例诊断为原发性ABC，7例诊断为继发性ABC，包括软骨母细胞瘤(chondroblastoma, CB)2例(图2B)，骨巨细胞瘤(giant cell tumour of bone, GCT)1例(图2C)，骨肉瘤1例，纤维结构不良1例，骨化性纤维瘤1例，慢性炎症1例；另外非ABC样改变的富于巨细胞的肿瘤4例，分别为骨囊肿2例，腱鞘巨细胞瘤1例，无明确诊断1例。2例FISH检测失败，最终诊断1例为纤维结构不良继发ABC，另1例结合病理特征及影像学表现，最终诊断为原发性ABC。

①A①B①C②A②B②C

本实验成功检测到18例原发性ABC、1例MO、2例NF存在USP6基因重排。FISH法检测USP6基因重排诊断原发性ABC的敏感性为69.2%(18/26)，特异性为100%(18/18)，准确率为75.8%(25/33)(表1)。

表1 40例骨和软组织病变标本中USP6基因重排情况

3 讨论

本实验探讨FISH检测USP6基因重排在骨和软组织病变(ABC、MO、NF等)病理诊断中的作用。本组病例检测到USP6基因重排的软组织病变包括原发性ABC、NF及MO。其中原发性ABC全部发生于骨，以脊柱最多见(81.4%)，脊柱病变中又以颈椎病变最多见(42.8%)，这些病例基本为我院骨肿瘤科送检的手术标本，可能与收治的患者以脊柱肿瘤多见有关。2例NF及1例MO具有典型的组织学特征，因发生部位较特殊，行USP6基因重排检测以辅助诊断，结果均为阳性。文献报道USP6基因重排还见于指趾纤维骨性假瘤[3]、颅骨筋膜炎[4]、富细胞腱鞘纤维瘤[5]等疾病。

利用FISH法对USP6基因重排进行检测，在骨和软组织肿瘤的病理诊断中具有广泛的运用前景，具有快速、准确且易于开展的优点，对诊断工作帮助较大。但在检测过程中也存在一些需要注意的问题。首先是样本的前处理，尤其是骨肿瘤标本，含骨质丰富，质地坚硬，需脱钙处理。普通强酸脱钙液因破坏蛋白质及核酸，影响免疫组化和基因检测，目前已不适用于骨病变的病理诊断。本组42例中2例检测不成功，镜下均未见任何有效荧光信号，可能与标本经酸脱钙软化处理时间过长有关。EDTA脱钙液和甲酸性质温和，对组织内的核酸和抗原损伤小[6-7]，目前已成为我科常规使用的脱钙液。EDTA脱钙液脱钙效果虽然更为理想，但脱钙时间长，最好同时配合使用超声脱钙仪，可以缩短脱钙周期。其次，在FISH制片过程中，杂交前煮片预处理与胃蛋白酶消化时间及程度是最关键的两个环节，杂交前煮片预处理可采用去离子水高温水煮法和EDTA修复液高温水煮法。经对比分析，对富含骨基质的切片，采用前者处理的组织细胞核轮廓完整、荧光信号强度适中且红绿信号对比度合适，背景干净，易计数。此外，合理控制胃蛋白酶的消化时间也很重要，本组骨和软组织标本是先进行了较短时间的消化处理，终止消化后，使用DAPI对核进行复染，观察细胞核的消化程度，如消化不足，可再用胃蛋白酶进行二次消化，直至得到较好的消化结果即为理想的胃蛋白酶消化时间。参考文献报道标准[8]，当镜下观察到DAPI复染后的核呈现细胞核完整，边缘完整略呈锯齿状、网格状时即为最优的消化结果。计数判读时，可先镜下观察HE染色形态(FISH检测应连续切3张组织切片，分别用于HE染色，FISH制片及备用)，圈出病变区域，再行FISH观察，需注意不管是原发性ABC或是继发性ABC，组织标本中成分复杂，富含炎症细胞和多核巨细胞，此类细胞几乎不出现USP6基因重排，应当不予计数。当阳性比值临近Cut-off值时，可以重新观察HE染色形态，重新换区域计数或采用双荧光信号通道选择红绿信号分离较多的区域进行计数，再观察HE染色形态确定所计数的区域是否为病变区域。当出现红绿信号分离间距小而又与内对照细胞红绿间距的状态存在差异时，可以选择相应的RT-PCR或二代测序等方法进行验证，如二代测序法验证出现新的USP6基因融合点位，也可设计新的FISH法融合探针予以反向验证检测，这既可以提高检测的敏感性，也可以确保结果的准确性。由于每个实验室的条件不同，发生重排的阴性阈值也不尽相同，我科选择适当的阴性病例做预实验，确定本实验室的阴性阈值。此外，需要至少两位分子学病理医师进行判读以减少判读误差。

USP6基因重排检测在骨与软组织富于巨细胞的病变及软组织低级别梭形细胞肿瘤的鉴别诊断中具有重要作用。巨细胞病变，如经典型原发性ABC与良性或恶性骨肿瘤继发的ABC及骨囊肿易混淆，而实体型ABC则与骨巨细胞瘤、软骨母细胞瘤、巨细胞修复性肉芽肿、棕色瘤、腱鞘巨细胞瘤等均存在形态学的重叠，导致鉴别诊断困难。近年来，随着骨肿瘤一些特异性标志物的出现及使用，Rehkamper等[9]提出4步法对这类肿瘤进行鉴别诊断，首先是根据影像学和形态学进行初步诊断，然后结合免疫组化法标记H3.3.G34W、H3.3.K36M的结果，阴性病例继续行FISH检测USP6基因重排情况，以上检测结果全部阴性的病例进行相应基因的测序。例如本组有1例形态学不典型、免疫组化及FISH结果均阴性的富于巨细胞的骨肿瘤，H3F3A和H3F3B测序也均阴性，最终结合影像学表现及病理特征后归入USP6阴性的原发性ABC。此外，另有2例免疫组化标记分别为H3.3.G34W、H3.3.K36M灶性阳性，FISH法检测USP6基因重排阳性，而H3F3A和H3F3B测序均阴性，最终诊断为原发性ABC，此2例说明当H3.3.G34W和H3.3.K36M免疫组化标记非弥漫阳性或可疑时，FISH法检测USP6基因重排具有必要性。Oliveira等[10]研究结果显示原发性ABC UPS6基因重排发生率为69%，本组为69.2%，结果与之一致，该报道还发现部分原发性ABC存在非USP6基因融合的其他基因融合类型。此外，存在部分H3F3A突变阴性的巨细胞瘤[11]。因此，如何更加精确地对富于巨细胞的骨和软组织肿瘤进行鉴别诊断，还有待深入探究。

在骨和软组织肿瘤中越来越多特异性基因突变被发现，提高了对疾病本质的认识，为精准诊断提供了更客观的指标。这些突变基因也可能是今后肿瘤靶向治疗的靶标。本组病例采用FISH法进行UPS6基因重排检测，在骨和软组织病变的诊断中具有较高价值，但也会出现结果的假阴性与假阳性，因此在骨和软组织病变的诊断中需要综合临床特征、影像学表现及病理特征。UPS6基因重排在骨和软组织病变的发生和发展中的作用也有待深入分析。