超薄切片电镜在肉瘤样肾细胞癌病理活检中的应用

武良美，王 璇，程 凯，马恒辉，陆珍凤，饶 秋，陈 辉

超薄切片电镜是生物透射电镜样品制备中最经典、最基础的实验技术方法，该技术在活检病理诊断特别是慢性肾脏疾病和肝脏代谢性疾病诊断中应用广泛[1]。随着免疫组化和分子病理技术的发展，其在肿瘤病理诊断中的应用已逐渐被边缘化。尽管如此，该方法在细胞凋亡、超微结构病理观察以及肿瘤鉴别诊断方面的研究仍具有广阔的应用前景。肉瘤样肾细胞癌(sarcomatoid renal cell carcinoma, sRCC)是指肾癌细胞发生肉瘤样分化的一种特殊病理学改变，可发生于所有肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)亚型中[2]。其发生率为1.6%～5.1%，具有典型的肿瘤内异质性，易复发和转移，预后差[3]。目前，尚未有针对sRCC内超微结构特征观察的研究报道。因此，本实验采用超薄切片电镜技术对sRCC活检病理诊断进行观察，总结不同sRCC亚型肿瘤细胞内超微结构的特征，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2021年1～10月中国人民解放军东部战区总医院存档的2例术中冷冻病理诊断为sRCC的标本，患者均为男性，年龄47、76岁。根据WHO/ISUP(2016)泌尿系统肿瘤分类、分级标准，1例诊断为透明细胞肾细胞癌伴肉瘤样分化(clear cell renal cell carcinoma with sarcomatoid differentiation, sccRCC)，另1例诊断为嫌色细胞肾细胞癌伴肉瘤样分化(chromophobe renal cell carcinoma with sarcomatoid differentiation, scRCC)，均为WHO/ISUP 4级。

1.2 方法

1.2.1冷冻切片HE染色 肿瘤新鲜组织均采用OCT包埋、Leica CM1950冷冻切片机6 μm厚连续切片、75%乙醇固定的常规术中冷冻方式进行操作，用于HE染色。

1.2.2电镜超薄切片 根据术中冷冻切片HE染色结果对新鲜组织块进行如下操作：(1)取材：分别取sccRCC及scRCC肉瘤样变区新鲜组织块，小于1 mm3。(2)固定：2.5%戊二醛1～2 h，PBS洗15 min×3次；1%饿酸2～3 h，PBS洗15 min×3次。(3)脱水：组织块依次经50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇与90%丙酮(1 ∶1)、90%丙酮及100%丙酮室温各15～20 min。(4)包埋：纯丙酮+包埋液(2 ∶1)室温3～4 h，纯丙酮+包埋液(1 ∶2)室温过夜，纯包埋液37 ℃ 2～3 h。(5)固化：37 ℃烤箱过夜，45 ℃烤箱内12 h，60 ℃烤箱24 h。(6)切片：超薄切片机切片，厚约70 nm。(7)染色：3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色。(8)JEM-1011透射电镜观察，拍片。

2 结果

2.1 光镜观察sccRCC细胞呈圆形或多边形，体积较大，胞膜清楚，呈透明状，胞质丰富淡染，少量红染，核呈粗颗粒状，略呈空泡状，核分裂象多见，可见少量透明细胞，周围被大小不一的薄壁血管构成网状间隔。局部伴沙砾样钙化及间质玻璃样变，钙化组织中见少量肉瘤样梭形细胞(图1)。scRCC细胞呈粉红色颗粒状细胞质，胞质嗜酸、核仁明显、密集且大小不一，部分瘤细胞圆形或不规则形，局部含大量梭形细胞，呈束状、编织状排列，偶见淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞浸润(图2)。

①②③④

2.2 电镜观察sccRCC细胞内可见脂滴，线粒体少见，并且糖原含量相对较少，未见细胞之间的紧密连接(桥粒)，肿瘤细胞和间质内可见基膜样物，少数还包裹类似吞噬小体(溶酶体)色深均质物，微囊泡少见(图3)。scRCC细胞内未发现脂滴，伴有多个肿胀线粒体，并且糖原相对丰富，细胞之间可见大小不等的紧密连接，部分有刷状微绒毛内衬的腔隙，绝大多数细胞胞质内有数量不等的微囊泡(图4)。

3 讨论

病理医师主要在光镜下进行肿瘤诊断，并辅以免疫组化等技术，但有些疾病或分化较差肿瘤的诊断及鉴别诊断必须依赖电镜甚至是超薄切片电镜[4]。超薄切片电镜的分辨率可达80万倍以上(0.3～0.4 nm)，能够观察到组织内各细胞器的内部结构以及细胞之间的连接类型，因此其在肿瘤的鉴别诊断中具有较大的优势。

由于sRCC组织学结构类似横纹肌肉瘤，免疫组化同时表达上皮和间叶组织抗原的双向标记，在光镜下对sRCC亚型进行分类较难[5-6]。因此，本实验首次采用超薄切片电镜进行观察，sccRCC与scRCC在糖原、脂肪生成、线粒体、微绒毛、微囊泡等超微结构方面差异明显，说明确实存在特殊的肉瘤样变的肿瘤微环境和肿瘤内异质性[7-8]，这就使现有的大规模研究数据(包括RNA、全外显子、单细胞测序等)与组织学表型的联系越来越复杂化[9-10]。作者猜测这些复杂的机制可能与肿瘤的异常代谢机制相关。由于sRCC发生率较低，其各亚型间也具有差异[3]，导致新鲜病例的收集率较低，今后在实际工作中要多与临床医师沟通、合作，为接下来更深入探索RCC细胞发生高级别(肉瘤样)转变代谢机制方面的研究准备好充足的临床资源。

总之，作为一种在超微结构水平的定位技术手段，超薄切片电镜下观察sRCC结构完整，细胞内基质结构清晰，为肿瘤细胞形态学的基础研究及临床诊断提供有价值的证据。近年来，随着电镜光学技术的不断发展和完善，再结合免疫组化、分子病理技术等，其将在肿瘤临床及科研工作中具有更广泛的应用前景，发挥其更大的作用。