子宫内膜样癌中X染色体耦联锌指蛋白的表达及RNA干扰后对细胞侵袭力的影响

张艳艳，董学彩，高玉霞，王文翔

子宫内膜癌作为女性绝经期高发的生殖道恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势[1]。随着现有的诊疗水平不断提高，该肿瘤早期诊断率、生存率及生存期不断改善[2]，但其具体发病机制仍未完全清楚，特别是晚期患者，治疗效果仍不佳且预后差[3]。因此，有必要进一步从分子水平明确子宫内膜癌发病机制，寻找敏感基因以指导该肿瘤的早期诊疗。X染色体耦联锌指蛋白(zinc finger protein X-linked, ZFX)作为锌指蛋白超家族成员，参与调控了基因表达、细胞分化、胚胎发育等过程[4]，并且在多种恶性肿瘤组织中出现异常表达[5]，在促进肿瘤细胞增殖、迁移中发挥重要作用[6]。然而，其是否参与子宫内膜癌发病鲜有报道。本实验采用免疫组化法检测子宫内膜癌组织中ZFX蛋白表达，分析其与临床病理特征的相关性，利用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞中ZFX mRNA的表达，观察其对增殖和侵袭的影响，以期为子宫内膜癌机制研究及早期诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2019年1月～2020年12月新乡市中心医院诊治的98例子宫内膜癌患者，纳入标准：(1)初次接受手术治疗，术后行病理学检查均为子宫内膜样腺癌；(2)术前均未行任何放、化疗；(3)临床资料完整。排除继发性肿瘤、其他系统恶性肿瘤者，以及急慢性炎症、严重肝肾功能障碍者。98例患者年龄28～75岁，平均(54.72±9.01)岁，根据2018年国际妇产科联盟(FIGO)分期标准：Ⅰ期52例，Ⅱ期25例，Ⅲ期21例；病理分级：G1 42例，G2 44例，G3 12例；有淋巴结转移者31例。同期，选取46例因子宫肌瘤行手术切除的正常子宫内膜组织作为对照，年龄26～74岁，平均(53.60±10.05)岁，两组患者年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本实验经新乡市中心医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂和设备免疫组化SP法试剂盒和配套试剂购自武汉博士德公司，兔抗人ZFX多克隆抗体购自美国Abcam公司，DAB和辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥公司，子宫内膜癌Ishikawa细胞系购自上海谷研生物公司，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒和Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录和PCR试剂盒购自日本Takara公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)液购自上海碧云天生物公司，二甲基亚砜(DMSO)购自上海徕仪生物公司，Transwell小室及基质胶购自美国Corning公司，iQ5实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 石蜡组织标本4 μm厚连续切片，经烤片、脱腊、梯度乙醇水化，浸入柠檬酸钠液中行微波抗原修复。将一抗兔抗人ZFX多克隆抗体按1 ∶600稀释后滴加，4 ℃过夜孵育，PBS冲洗3次，滴加二抗，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水、封固，镜下观察。以PBS替代一抗作阴性对照。ZFX蛋白主要表达于细胞核，采用半定量法[7]进行评分：(1)按阳性细胞百分比评分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；(2)按阳性细胞染色强度评分：不着色为0分、淡黄色为1分、黄褐色为2分、棕褐色为3分；将两项得分结果相乘：<2分为阴性，≥2分为阳性。

1.3.2细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养Ishikawa细胞，条件：5%CO2、37 ℃。待细胞融合度达80%时，胰酶消化、传代培养。用Lipofectamine 2000转染试剂盒对对数生长期细胞进行分组转染：(1)si-ZFX组：转染ZFX的siRNA序列：5′-UGAAAUCGCUGACGAAUGG-3′；5′-ACACAGAGUCGGAAAUUGA-3′；(2)si-对照组：转染阴性对照序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′；(3)空白组：不作任何处理。各组处理后培养48 h。

1.3.3qRT-PCR 取各组转染后的培养细胞，细胞裂解液裂解，用Trizol试剂提取总RNA，使用紫外分光光度计对其纯度和浓度检测。用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，用实时荧光定量PCR仪按PCR试剂盒说明书进行扩增，ZFX引物序列：上游5′-TATGGATTCACTCGTCAA-3′，下游5′-CTCAGATGTAACAGAAGAAG-3′；β-actin引物序列：上游5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′，下游5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′。反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，合计38个循环。用2-ΔΔCt法计算细胞中ZFX mRNA的相对表达量。

1.3.4MTT法 取转染后对数生长细胞，胰酶消化，离心后制备单细胞悬液，密度为每毫升2.5×104个细胞，按每孔200 μL接种于96孔板，继续在5%CO2、37 ℃培养箱中培养。分布于12、24、48、72和96 h时，往各孔加入MTT液20 μL，培养4 h，停止培养，弃去培养液，加入DMSO 150 μL，振荡15 min。用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度A值。重复实验3次。

1.3.5Transwell实验 取转染后对数生长细胞，胰酶消化，离心后用无血清培养液制备单细胞悬液，密度为每毫升2.5×105个细胞。将细胞悬液200 μL接种于Transwell小室上室，下室则加入600 μL含10%胎牛血清的培养液。培养24 h，经10%中性福尔马林固定，结晶紫染色，并用棉签将上室内散落细胞拭去，镜下观察，随机取5个高倍视野计数穿膜细胞数代表细胞迁移能力，重复实验3次。在检测细胞侵袭力时，则提前24 h用培养液对基质胶进行稀释后，平铺于小室上室，过夜风干备用，其余步骤同迁移实验。

2 结果

2.1 子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中ZFX蛋白表达子宫内膜癌组织中ZFX蛋白阳性率为74.49%(73/98)，高于正常子宫内膜组织(23.91%，11/46)，差异有统计学意义(χ2=32.947，P<0.001，图1)。

AB

2.2 ZFX蛋白表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系ZFX蛋白表达与子宫内膜癌患者年龄、肿瘤直径、浸润深度无关(P>0.05)，与病理分级、FIGO分期和淋巴结转移相关(P<0.05，表1)。

表1 ZFX蛋白表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 子宫内膜癌三组细胞中ZFX mRNA表达si-ZFX组、si-对照组和空白组细胞中ZFX mRNA相对表达量分别为0.26±0.07、1.01±0.09和1.03±0.10，差异有统计学意义(F=136.233，P<0.001)，si-对照组和空白组细胞中ZFX mRNA相对表达量差异无统计学意义(P=0.176)，si-ZFX组细胞中ZFX mRNA相对表达量低于si-对照组和空白组(P<0.05)。

2.4 子宫内膜癌三组细胞的增殖活性si-ZFX组24、48、72和96 h时细胞吸光度A值均低于si-对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 三组细胞不同时间点吸光度A值比较

2.5 子宫内膜癌三组细胞迁移和侵袭能力si-ZFX组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于si-对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05，表3，图2)。

表3 三组细胞迁移和侵袭能力比较个)

si-ZFX组si-对照组空白组迁移侵袭

3 讨论

子宫内膜癌发病机制复杂，由于早期症状不典型，多数患者就诊时已处于中晚期，错失最佳治疗时机[8]。目前，手术辅以放、化疗仍是患者主要治疗手段[9]，但术后高复发率和高病死率一直是临床医师亟待解决的问题。因此，积极从分子水平探讨与子宫内膜癌发生、进展相关敏感基因，实现对患者早期诊疗，对改善患者预后意义重大。ZFX作为锌指蛋白超家族成员之一，广泛存在于真核生物体内并参与调控众多生物学功能，与胚胎发育及干细胞自我更新密切相关[10]。近年研究发现[11]，其可充当转录激活因子而参与多种人类肿瘤的发生。有研究指出[12]，ZFX异常表达与胰腺癌发生、进展密切相关，可作为判断患者预后的指标。崔纪芳等[13]研究发现胃癌组织中ZFX基因和蛋白水平均异常升高，并与患者临床病理特征相关。Wu等[14]研究发现ZFX促进食管鳞状细胞癌的发生及化疗耐药。亦有研究[15]发现沉默ZFX可阻碍非小细胞肺癌进展。本实验结果显示，子宫内膜癌组织中ZFX蛋白阳性率高于正常子宫内膜组织，说明ZFX蛋白在子宫内膜癌组织中高表达，可能在促进子宫内膜癌发生中发挥重要作用。本实验结果显示，病理分级G2～G3、FIGO分期Ⅱ～Ⅲ期和发生淋巴结转移的子宫内膜癌组织中ZFX蛋白阳性率升高，说明ZFX蛋白表达与子宫内膜癌恶性化指标有关，可能参与了子宫内膜癌进展。

为进一步观察ZFX在子宫内膜癌发生、发展中的作用，本实验利用siRNA技术特异性抑制Ishikawa细胞中ZFX基因表达，结果显示，si-ZFX组细胞中ZFX mRNA相对表达量低于si-对照组和空白组，说明Ishikawa细胞中ZFX基因表达被成功抑制。有研究指出[16]，ZFX通过MAPK途径促进胰腺癌细胞的增殖。亦有研究指出[17]，靶向沉默ZFX表达可抑制肝内胆管癌细胞克隆、增殖。本实验结果显示，si-ZFX组24、48、72和96 h时细胞吸光度A值均低于si-对照组和空白组，说明抑制Ishikawa细胞中ZFX基因表达可明显降低细胞增殖活性，提示ZFX可能与细胞增殖密切相关。多项研究表明[18-20]，ZFX参与调控了恶性肿瘤细胞迁移和侵袭过程。本实验结果显示，si-ZFX组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于si-对照组和空白组，说明抑制Ishikawa细胞中ZFX基因表达可明显抑制细胞迁移和侵袭力，提示ZFX可能参与了子宫内膜癌细胞迁移和侵袭过程。

综上所述，ZFX蛋白在子宫内膜癌组织中高表达，与病理分级、FIGO分期和淋巴结转移有关，抑制Ishikawa细胞中ZFX基因表达可降低细胞增殖活性，抑制细胞迁移和侵袭力，有望为子宫内膜癌机制研究及早期诊疗提供新的靶位。