肿瘤浸润淋巴细胞联合残余肿瘤负荷在乳腺癌新辅助化疗中的预后价值及意义

钟燕燕，王进京，钟恋君，罗 帅，郑 洪

乳腺癌作为全球癌症死亡的第二大因素，其病死率占所有癌症死亡原因的11.6%[1]。残余肿瘤负荷(residual cancer burden, RCB)指数考虑了残留肿瘤床、残余肿瘤细胞比例和淋巴结转移等多种情况，可对乳腺癌患者术后进行残余疾病评估[2]。鉴于新辅助化疗后仍有较多乳腺癌患者不能达到病理完全缓解(pathological complete response, PCR)(PCR指乳腺癌原发灶及腋窝淋巴结手术标本病理检查均未见浸润性肿瘤细胞残余)，采用RCB系统分层评估成为病理精准诊断的重要内容[3]。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)介导的适应性免疫反应是有效且持续的抗肿瘤反应的关键性基础，肿瘤周围微环境中的TILs也被认为在肿瘤免疫机制中起着免疫应答和调控作用[4-5]。RCB系统只考虑了残余疾病情况，并未对宿主免疫应答情况进行考察，这有可能会对预后分析的准确性造成一定程度的偏差，而RCB与TILs的结合将会为我们带来更多有效的预后信息。本实验将RCB和TILs结合，定义为“RCB-TILs”指标，分析验证该指标与乳腺癌临床病理特征及预后的关系，为预测临床疗效提供新思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2015年1月～2019年10月遵义医科大学附属医院病理科存档的空心针穿刺病理活检诊断为浸润性乳腺癌，并接受新辅助化疗后行手术切除的乳腺癌患者106例，所有病例均经两位以上有经验的病理学专家确诊。收集其临床和病理资料，包括患者年龄、组织学特征、免疫表型、淋巴结转移及存活时间等，存档蜡块组织健全。

1.2 乳腺癌分子分型根据ER、PR、HER-2和Ki-67的免疫表型，将乳腺癌分为4个亚型：管腔A型(ER/PR阳性，且PR阳性率≥20%，HER-2阴性且Ki-67增殖指数<20%)、管腔B型(ER/PR阳性，HER2阴性，Ki-67增殖指数≥20%或PR阳性率<20%；ER/PR阳性，HER-2阳性及Ki-67增殖指数任何表达水平)、HER2过表达型(ER/PR阴性，HER-2阳性)和三阴型(ER、PR及HER-2均阴性)。本实验将管腔A型和管腔B型归为激素受体阳性乳腺癌(hormone receptor positive breast cancer, HRBC)。ER、PR、HER-2和Ki-67免疫组化结果判读及分子分型参照最新对应指南进行[6-8]。

1.3 RCB的组织病理学评估RCB由MD Anderson肿瘤中心提出，根据原发肿瘤(原发肿瘤床面积、肿瘤细胞占瘤床百分比和原位癌百分比)和淋巴结转移(阳性淋巴结数量和最大转移直径)的数据自动计算RCB[9]。RCB计算公式为：RCB=1.4(浸润癌所占比例×原发灶肿瘤直径)0.17+[4(1-0.75转移淋巴结数目)×淋巴结转移最大径]0.17。根据计算结果将RCB分为三类：微小残留疾病(RCB-Ⅰ)、中度残留疾病(RCB-Ⅱ)或广泛残留疾病(RCB-Ⅲ)。由于RCB-Ⅰ被认为比RCB-Ⅱ和RCB-Ⅲ具有更好的预后，因此将RCB-Ⅰ归为阳性，RBC-Ⅱ和RCB-Ⅲ归为阴性。

1.4 TILs的组织病理学评估根据乳腺癌免疫肿瘤学生物标志物工作组的报告[10]，在术前经空心针穿刺病理标本的HE染色切片上评估肿瘤基质TILs。以所研究视野的比例表示，在400倍放大倍数下评估单核炎性细胞占肿瘤基质面积的百分比，原位癌和挤压伪影等区域不包括在内。浸润性肿瘤细胞巢周围单核炎性细胞浸润与基质面积比例分别按>50%、10%～50%和≤10%进行分类。>50%、10%～50%归为TILs阳性，≤10%归为阴性。

1.5 RCB-TILs评估RCB和TILs评估相结合，创建了“RCB-TILs”。RCB阳性且TILs阳性的患者被视为RCB-TILs阳性，任意RCB和(或)TILs阴性均被视为RCB-TILs阴性。

1.6 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，应用Pearson Chi-Square检验或Fisher精确检验进行分类变量相关性分析。采用Kaplan-Meier法评估无瘤生存期(disease free survival, DFS)，组间比较采用Log-rank检验。Cox比例风险模型进行单因素和多因素生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征乳腺癌新辅助化疗前空心针穿刺及配对的新辅助化疗后手术标本TILs的HE染色如图1所示，合计106例，均为女性患者。其中HRBC 66例，HER-2过表达型乳腺癌(HER-2 positive breast cancer, HER2BC) 24例，三阴型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)16例。平均年龄(47.3±9.4)岁(29～72岁)。在接受新辅助化疗的患者中，34例(32.1%)为RCB-TILs阳性，72例(67.9%)为阴性。依据术后病理状态将乳腺癌患者分为病理完全缓解(pathological complete response, PCR)组和非病理完全缓解(non-pathological complete response, non-PCR)组。其中18例(17.0%)为PCR，88例(83.0%)为non-PCR。

2.2 RCB-TILs与新辅助化疗后乳腺癌临床病理特征的关系在新辅助化疗后的乳腺癌组织中，RCB-TILs阳性与乳腺癌肿瘤直径、淋巴结转移、脉管侵犯及病理状态具有相关性(P<0.05)。RCB-TILs阳性患者占肿瘤直径<2 cm组及肿瘤直径>2 cm组的比例分别为50%(16/32)和24.3%(18/74)，前组是后组的2.06倍，RCB-TILs阳性患者肿瘤直径<2 cm可能性更大；RCB-TILs阳性患者占无淋巴结转移组及有淋巴结转移组的比例分别为52.5%(32/61)和4.4%(2/45)，前组是后组的11.9倍，RCB-TILs阳性患者更不易发生淋巴结转移；RCB-TILs阳性患者占无脉管侵犯组及有脉管侵犯组比例分别为36.7%(33/90)和6.2%(1/16)，前组是后组的5.9倍，RCB-TILs阳性患者更不易发生脉管侵犯；RCB-TILs阳性患者占PCR组及non-PCR组的比例分别为72.2%(13/18)和23.9%(21/88)，前组是后组的3.02倍，RCB-TILs阳性患者更易获得PCR。RCB-TILs阳性与患者年龄、Ki-67增殖指数及组织学分级无关(P>0.05，表1)。

ABC

表1 RCB-TILs与新辅助化疗后乳腺癌临床病理特征的相关性[n(%)]

2.3 RCB-TILs与新辅助化疗后乳腺癌患者预后的关系随访106例患者，中位随访时间34个月(3～75个月)，其中85例患者存活且未发生病变复发、恶化、转移等，21例无瘤生存。根据RCB-TILs状态进行DFS分析，结果显示新辅助化疗后乳腺癌RCB-TILs阳性患者的DFS长于RCB-TILs阴性患者，差异有统计学意义(P=0.049 9，图2)。

图2 RCB-TILs与新辅助化疗后乳腺癌患者预后的关系

2.4 Cox单因素及多因素生存分析新辅助化疗后乳腺癌患者预后相关因素Cox单因素分析显示，患者年龄、肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移、脉管侵犯、分子分型、病理状态、Ki-67增殖指数、RCB-TILs状态、TILs强度均对患者DFS无明显影响(P>0.05)；Cox多因素分析显示，RCB-TILs阳性是经新辅助化疗患者的有利因素，结果表明与RCB-TILs阴性相比，RCB-TILs阳性更有助于延长患者的DFS(HR=0.068，P=0.003，表2)。

表2 乳腺癌患者预后的Cox单因素和多因素生存分析

3 讨论

乳腺癌的新辅助化疗方法已被广泛接受并应用，发现一个精准有效的指标预测新辅助化疗预后对乳腺癌患者临床后续诊疗评估至关重要。RCB可以准确识别出具有高复发风险的TNBC及HER2BC患者[11]。RCB分类越高，后续复发、转移及扩散的可能性越大，可以为新辅助化疗后non-PCR患者的复发风险做一系列的连续性预测，成为乳腺癌预后评估更加准确的方式[12-14]。

研究表明，乳腺癌组织中高TILs浸润表现出更好的预后，并且还可以通过TILs的浸润程度评估新辅助化疗的治疗效果[15]。经新辅助化疗的原发性TNBC中治疗前高TILs与PCR率的增加、更长的DFS和总生存期(overall survival, OS)具有相关性[16]。作为预测新辅助化疗疗效指标，PCR有助于预测TNBC和HER2BC患者预后，但有研究指出其不作为预测HRBC的生存指标，同时，在对治疗反应的预测中，TILs也仅能预测TNBC和HER2BC对新辅助化疗的反应[17]。Laas等[18]研究发现，将TILs评估联合RCB评分可有效提高RCB评估系统的预测效能。

本实验将RCB和TILs结合，分析RCB-TILs在乳腺癌新辅助化疗中的预后作用及临床意义。有研究显示RCB-TILs是新辅助化疗后所有浸润型乳腺癌复发的重要预测因子，可能成为代表新辅助化疗疗效的有效指标，且RCB-TILs阳性TNBC患者占比更多，HRBC患者占比更少，与RCB-TILs阴性患者相比，阳性患者更易获得PCR[19]，这与本实验结果保持一致。本实验Cox多因素分析显示，RCB-TILs阳性是行新辅助化疗患者的有利因素，Kaplan-Meier分析显示RCB-TILs阳性患者的DFS更长。Pinard等[20]的研究结果亦证实RCB指数和CD4+TILs的组合有助于改善新辅助化疗后TNBC患者预后的预测能力。TNBC残余疾病中TILs的水平与新辅助化疗后乳腺癌患者RFS和OS改善明显相关，并且为RCB指数增加了进一步的预后信息[21]。且RCB-TILs受试者工作特征曲线分析表明，RCB-TILs对所有乳腺癌患者预后的预测能力均优于TILs和RCB，RCB-TILs阳性有助于延长所有患者DFS，可能成为新辅助化疗后乳腺癌复发的独立预测因素[19]。除此之外，RCB-TILs阳性患者的肿块更小、淋巴结转移及脉管侵犯更少。

综上，本实验结合新辅助化疗前TILs浸润情况，RCB-TILs与新辅助化疗后乳腺癌肿瘤直径、淋巴结转移、脉管侵犯等具有相关性，其可能成为新辅助化疗后乳腺癌DFS的潜在生物学标志物，对临床后续的诊疗及评估具有指导意义。