脐带间充质干细胞对于盆腔炎性后遗症大鼠的治疗作用及机制初探

蒲茜，余蕾

盆腔炎性后遗症(sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID)是临床上妇科常见的一组疾病，是由于盆腔炎患者未及时接受规范治疗或接受治疗后仍迁延不愈、反复发作导致[1]，表现为子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔周围结缔组织炎等。据估计，15～50岁的女性中有4%～20%患有SPID[2]。

SPID病程绵长、迁延不愈，且增加了女性不孕、慢性盆腔痛、异位妊娠等多种并发症的风险，对女性的身心健康造成巨大影响[3]。SPID的发病机理复杂,至今尚未明确，其可能的机制包括：病原体侵袭、氧自由基清除异常、血液动力异常、免疫系统紊乱等[4-5]。其中免疫系统紊乱学说是当今研究的热点，资料表明女性生殖系统中分布着大量Toll样受体(TLRs)，当其被激活后(主要包括TLR2、TLR4)可通过不同的途径引起一系列的信号转导，引发大量细胞因子和趋化因子的分泌从而诱发炎症[6]。国际性传播感染联合会(IUSTI)和疾病预防控制中心(CDC)将抗生素作为SPID推荐用药[7]，但是引起SPID的病原体是多种多样的，有时还会存在无细菌感染的SPID患者，因此抗生素治疗的有效性仍存在不确定性。此外，有越来越多的证据表明，抗生素还会产生胃肠道疾病、肝脏毒性、皮肤过敏等不良作用，因此本研究将从免疫调控出发，探索新的治疗方案。

脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)是一种具有免疫调控作用的细胞，研究表明UCMSCs可通过调低TLR2、TLR4的表达降低炎症因子释放(包括IL-4、IL-6、IL-8等),从而改善炎症情况。因此UCMSCs对SPID可能存在治疗作用,同时UCMSCs具有取材方便、清洁度高、易于在体外培养、增殖能力强、免疫原性低且不受伦理道德限制等优点[8-9]。基于此，本研究将从TLR/MyD88/NF-κB通路出发探讨UCMSCs对于SPID大鼠的保护作用及作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验细胞与动物

UCMSCs，购于美国Scien Cell Research Laboratories。SD大鼠35只，雌性，未受孕8周龄，体重约(250±20)g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司[生产许可证号:SCXK(辽)2020-0001]。饲养于贵州医科大学动物中心，饲养条件:室温(23±2)℃，12 h光照/12 h黑暗交替，自由摄水、食，适应性饲养1周。

1.2 药品与试剂

妇科千金片(株洲千金药业有限公司)；白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特)；TNF-α、NF-κB抗体购于博奥森生物技术公司；TRL2，TRL4，MyD88抗体购于美国Affinity Biosciences公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及SPID模型的建立 参照Zhang LJ等[10]的方法造模，雌性未受孕SD大鼠35只，随机选取8只作为空白对照组(Control组)，剩下27只进行SPID造模。用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，于下腹做1 cm左右切口，游离周围组织暴露双侧子宫，沿子宫根部分别向两侧宫腔注射金黄色葡萄球菌与大肠杆菌制备的细菌混悬液0.1 mL(约1×109CFU/mL)。造模后适应性喂养14 d随机抽取3只造模大鼠检验是否造模成功，确认成功后，将剩余24只造模大鼠随机数字表法分为模型组(SPID组)、妇科千金片治疗组(Drugs组)、UCMSCs治疗组(Cells组),每组8只。

1.3.2 药物及细胞干预 Drugs组按0.25 g/kg进行灌胃妇科千金片(根据标准药理学实验中动物和人之间的等效剂量公式换算)，每天1次，连续干预21 d。Cells组于造模后14 d的第1天、第7天、第14天进行尾静脉注射2 mL UCMSCs悬液(3×106/mL)。

1.4 标本采集与处理

末次尾静脉注射后，正常喂养7 d，待Drugs组末次灌胃后，所有组别同时禁食不禁水，次日麻醉开腹，腹主动脉采血，静置1～2 h。取血后充分暴露子宫，记录腹内情况后取下双侧子宫，一侧置于4%多聚甲醛溶液标号用于病理学和免疫组化检测，一侧置于冻存管中标号后置于-80℃冰箱保存用于蛋白印迹检测(均为左侧子宫置于4%多聚甲醛，右侧-80℃冻存)。取材完毕后将静置的血液进行离心，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液于2 mL EP管内，标号后置于-80℃冰箱保存用于ELISA检测。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 大鼠盆腔及子宫形态 开腹后对比观察双侧子宫有无充血、积液、包块、粘连等情况。

1.5.2 大鼠子宫组织病理形态 将保存于4%多聚甲醛溶液中的子宫组织取出，使用梯度酒精对组织进行脱水处理；然后使用二甲苯进行组织透明；再将透明后的组织块进行石蜡包埋、切片、HE染色后，显微镜下观察子宫组织病理学变化。

1.5.3 免疫组织法测大鼠子宫组织中TNF-α、NF-κB的表达 将大鼠子宫按照免疫组化方法依次进行组织脱水、组织透明、石蜡包埋、切片、烘片、抗原修复、抗原封闭、滴加一抗二抗、DAB显色、苏木素复染、脱水、中性树脂封片，切片晾干后成像观察。选取3个不同视野采集图像，运用IPP6.0图像分析软件分析相关蛋白的相对表达量(平均光密度值表示)。

1.5.4 ELISA法测定血清IL-4、IL-6、IL-10水平 取待测血清，采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书操作，测定血清中IL-4、IL-6、IL-10水平。

1.5.5 蛋白印迹法测定大鼠子宫中TLR2、TLR4、MyD88蛋白表达 将冻存于-80℃的子宫组织充分裂解后，用移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中，然后在4℃下12 000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管中并置于-20℃保存。蛋白质定量后依次进行制胶、电泳分离、转膜、免疫印迹显色(封闭、一抗二抗孵育、显色曝光)后采集图像，采用Image J软件分析各组显色蛋白条带的平均灰度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 4组大鼠子宫形态观察

Control组：大鼠子宫大小、形态正常，活动度正常，无明显充血及水肿，无包块形成，与周围组织无粘连。SPID组：大鼠子宫与周围盆腔组织广泛粘连，质地变硬，部分大鼠急慢性混合感染，子宫出现明显充血、积液、蓄脓的情况。Drugs组：大鼠子宫活动度一般，周围盆腔组织粘连较轻，子宫形态部分恢复正常。Cells组：大鼠子宫活动度较好，质地较软，与周围盆腔组织粘连明显减轻，与Drugs组相当，子宫形态部分恢复正常。

2.2 4组大鼠子宫病理观察

Control组：子宫壁各层形态完整，无腺体增生及破坏，无炎症细胞浸润；SPID组：子宫壁各层分界不清，上皮细胞大量坏死脱落伴增生，部分腺体结构被破坏，排列紊乱，伴有大量炎性细胞浸润。Drugs组：子宫壁各层形态较完整，上皮细胞稍有坏死脱落伴有少量炎性细胞浸润。Cells组：子宫内膜上皮细胞结构基本完整，少量炎性细胞浸润，细胞排列较规则。见图1。

图1 4组大鼠子宫病理情况(HE,×200)

2.3 4组大鼠子宫组织中TNF-α、NF-κB的表达比较

与Control组相比,SPID组大鼠子宫组织中TNF-α、NF-κB的相对表达量均显著增加(P<0.01)，表明模型建立成功。与SPID组相比,Drugs组和Cells组的TNF-α、NF-κB的相对表达量均降低(P<0.05)，表明UCMSCs与妇科千金片对TNF-α、NF-κB均有下调作用；TNF-α的表达水平在Drugs组与Cells组之间差异无统计学意义(P>0.05)，NF-κB在Cells组中的表达水平明显低于Drugs组(P<0.01)，表明UCMSCs在下调SPID大鼠体内NF-κB的效果略优于妇科千金片。见下页图2、图3。

图2 4组大鼠子宫组织中TNF-α、NF-κB的表达(IHC，×400)

2.4 4组大鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10水平比较

与Control相比,SPID组大鼠血清中IL-6水平显著增加(P<0.01)，IL-4、IL-10水平明显降低(P<0.01)。与SPID组相比,Cells组和Drugs组的IL-6水平均明显降低(P<0.01)，Cells组中IL-4、IL-10水平明显增加(P<0.01)，Drugs组中IL-4水平略有增加但差异无统计学意义(P>0.05)，IL-10水平明显增加(P<0.01),Cell组中IL-4较Drugs组增加明显(P<0.01)；其余指标水平在Drugs组与Cells组之间差异无统计学意义(P>0.05)，表明UCMSCs与妇科千金片对于SPID的治疗效果接近。见下页图4。

注:★表示与Control组相比P<0.05,★★表示P<0.01,●表示与SPID组相比P<0.05,●●表示P<0.01,■表示与Drugs组相比P<0.05,■■表示P<0.01。

注:★表示与Control组相比P<0.05,★★表示P<0.01,●表示与SPID组相比P<0.05,●●表示P<0.01。

2.5 4组大鼠子宫组织中TLR2、TLR4、MyD88蛋白的表达比较

与Control组相比,SPID组大鼠子宫组织中TLR2、TLR4、MyD88蛋白表达水平均显著增加(P<0.01)。与SPID组相比,Drugs组和Cells组的TLR2、TLR4、MyD88蛋白的表达水平均降低(P<0.01)；上述蛋白水平在Drugs组与Cells组中表达差异无统计学意义(P>0.05)，表明UCMSCs与妇科千金片对于SPID的治疗效果相当。见图5、下页图6。

图5 4组大鼠子宫组织中TLR2、TLR4、MyD88蛋白的表达

注:★表示与Control组相比P<0.05,★★表示P<0.01,●表示与SPID组相比P<0.05,●●表示P<0.01。

3 讨论

SPID作为一种困扰女性的常见病，轻者会出现表现月经不调、盆腔疼痛、白带异常等症状，重者会出现异位妊娠、不孕、败血症等严重后果。目前对于SPID的机制研究尚未明确，因此对其常采用对症治疗，如：(1)应用抗生素抗感染治疗，但抗生素一般应用于急性感染期，对于已经形成的组织损伤及粘连治疗效果欠佳；(2)应用手术解除粘连、包块或梗阻，手术为有创手段，可能会造成其他的损伤；(3)应用微波治疗减少结缔组织增生等；(4)应用中药或针灸减缓慢性炎症，防止组织进一步增生，但以上方法治疗效果参差不齐，容易反复。而间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为一种具备强大的自我更新能力和多向分化能力的细胞，能对受损组织起到修复及保护作用，同时它还能通过多种途径对机体进行免疫调控，从而起到抗炎的作用。因此本实验将采用HUMSCs对SPID进行治疗，并进一步探索其可能存在的作用机制。

TLR/MyD88/NF-κB通路在SPID中发挥重要作用[11-12]，当病原体入侵女性生殖系统时，会激活广泛分布在生殖系统中的TLRs，其中主要包括TLR2、TLR4[13]。TLRs是一种模式识别抗体，与人体的固有免疫有着密切关系。MyD88是TLRs信号通路中一个关键的衔接蛋白，当生殖系统中TLRs被激活后，活化下游的 MyD88，最终激活 NF-κB，促进炎症因子的释放，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等，最终导致炎症发生[14]。相关报道显示，抑制TLR/MYD88/NF-κB通路，可减轻盆腔炎症状，改善预后[15]。

MSCs在先天免疫与适应性免疫中都具有免疫调节作用，但是MSCs的免疫调节作用与炎症微环境中各种细胞因子息息相关[16]。当炎症发生后，MSCs可迅速参与到炎症微环境的形成中。在早期，MSCs可促进炎症因子释放清除病原体；晚期时，抑制过强的炎症反应，促进组织修复[17]。且有研究表明，MSCs在一些存在炎性损伤的疾病中，能降低TLR2、TLR4的表达，从而起到修复组织改善病情的作用[18]。因此本研究将盆腔炎可能存在的免疫学机制与MSCs的免疫调节功能联系起来，通过TLR/MYD88/NF-κB通路探讨UCMSCs是否对SPID有治疗作用。

SPID目前缺乏特异性的治疗手段，根据2020年发布的《中成药治疗盆腔炎性疾病后遗症临床应用指南》，妇科千金片为治疗SPID的推荐用药[1]。妇科千金片由功劳木、单面针、千斤拔、当归、穿心莲、党参、鸡血藤、金樱根等组成，具有益气养血、活血化瘀等功效[19]。但中成药起效慢，作用机理复杂，尚未得到广泛认可。在部分文献报道中表明妇科千金片治疗SPID的作用机制或与下调TLR相关，基于其临床疗效及可能存在的作用机制，本实验将其作为与HUMSCs治疗SPID的对比用药[20]。

在SPID发生发展中，会产生大量的炎性因子，包括TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10等。这些因子会扰乱机体正常免疫调控，引发细胞联级反应，产生更多的炎症介质释放，加重炎症反应[21]。其中TNF-α、IL-6属于前炎症因子，具有趋化作用，可促进炎症细胞的聚集与活化，加剧炎症[22]；IL-4、IL-10均为抗炎因子，其中IL-4主要来源于Th2细胞，IL-10主要来源于巨噬细胞、B细胞、T细胞等，在炎症发生过程中，这两种因子的增加可有效地减轻炎症反应[23]。本实验中，SPID组大鼠中TNF-α、IL-6水平明显增加，IL-4、IL-10水平显著下降，细胞因子严重失衡，出现明显炎症反应。而Cells组与Drugs组在给予治疗后，组织中的TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB的表达较SPID组均明显降低，从而减少了下游TNF-α、IL-6等炎性因子的释放，同时还上调了抗炎因子IL-4、IL-10的释放，使得炎症减轻。这表明HUMSCs可通过下调TLR/MyD88/NF-κB信号通路，抑制下游炎症因子的表达从而起到抗炎作用，且本研究结果表明HUMSCs抑制NF-κB的作用略优于妇科千金片。NF-κB是一种普遍存在的核转录因子，参与介导了细胞炎症、细胞炎增殖、分化、凋亡和免疫应答等生理活动，研究表明在NF-κB被激活后，体内释放大量炎症因子，而这些炎症因子中，TNF-α和IL-1β的表达又可进一步增加NF-κB的活性，引起其他炎症介质的释放，放大炎症信号，增加炎症程度[24]。因此降低NF-κB的表达可有效地改善SPID大鼠的症状。相对于传统的口服药来说，HUMSCs具有治疗次数少的优点，但同时有治疗方式复杂的缺点，如果可以利用间充质干细胞的归巢性，开发灌洗类、口服类药剂，将大大提高其利用率。

综上，本研究结果表明HUMSCs可通过下调TLR/MyD88/NF-κB通路减少促炎因子释放，上调抗炎因子的表达从而减轻SPID大鼠的炎症反应，达到治疗SPID的效果，有望成为治疗盆腔炎的新型药物。