线粒体靶向抗氧化剂SS31对家兔卵巢组织冷冻效果的影响研究

范雪梅，何丽冰，曾琴，栾宗桧,，刘如月,，韩长利，曾玖芝，刘伟信,*

卵巢组织冷冻和移植是一种重要的生育力保存方式，但冷冻复苏过程中伴随着大量卵泡损伤及凋亡，限制了其临床应用。研究发现线粒体靶向抗氧化剂SS31(D-Arg-2,6-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)是一种小分子可渗透细胞的肽家族，能够靶向定位和聚集在活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生的部位——线粒体内膜，含量可高达5 000倍，具有内在的抗氧化活性，能减少细胞凋亡，降低生理及病理条件下ROS水平[1-2]，对于保护线粒体功能、抗氧化应激以及预防和治疗小鼠的缺血再灌注损伤有明显作用[3-5]。除了抗氧化活性，SS31还具有改善线粒体呼吸和促进ATP合成的作用[6]。通过大量的离体器官研究和氧化应激相关疾病模型的研究证实SS31对细胞的保护作用显著，能有效避免细胞因氧化应激反应凋亡[7]。目前尚不清楚其对卵巢组织冷冻复苏效果的影响。本研究将不同浓度SS31添加于冷冻液和复苏液中用于家兔卵巢组织冷冻保存，探讨SS31对于卵巢组织冷冻是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂

线粒体靶向抗氧化剂SS31，由上海强耀生物科技公司生产；PBS溶液由美国Gibco公司生产；TUNEL试剂盒由瑞士罗氏公司生产；胰蛋白酶K(proteinase K)由美国Merck Millipore公司生产。

1.2 实验动物

自成都达硕实验动物有限公司购买15只健康成熟雌性家兔，4～5月龄，体重1.8～2.2 kg。普通饲料饲养，自由摄水，光照周期12 h，动物房温度24℃左右，饲养7 d后开始实验。

1.3 实验模型制作及分组

切除家兔双侧卵巢，保留卵巢皮质部分，修剪成5×3×1 mm3大小的组织块，将30个卵巢皮质片段，随机分成6组(n=5)。FRESH组：新鲜卵巢皮质片段；CONTROL组：常规冷冻复苏，卵巢冷冻保护液和复苏液中无SS31；5 μM-SS31组、10 μM-SS31组、20 μM-SS31组、40 μM-SS31组：在卵巢冷冻保护液和复苏液中分别加入5、10、20、40 μM SS31。

1.4 卵巢组织冷冻与复苏

采用汪翔等[8]报道的玻璃化冷冻方法对卵巢皮质片段进行冷冻，一周后解冻卵巢组织。复苏完成后，一部分经固定、石蜡包埋、切片后用于HE染色和TUNEL检测，一部分经3%戊二醛固定制作电镜标本。

1.5 卵巢组织HE检测

卵巢组织经固定、脱水、石蜡包埋，切片机3 μm连续切片，每间隔10张选取一张切片经HE染色后，于光学显微镜下进行卵巢组织学检测。随机选择1个视野(非坏死及出血、非特异性染色的边缘区)，观察各组卵巢组织结构的改变、卵泡形态的变化。

1.6 卵泡凋亡检测

每间隔10张选取一张卵巢组织切片行TUNEL检测，观察卵泡DNA损伤情况。光学显微镜下细胞核固缩深染、棕黄色或棕褐色的细胞核、背景呈紫蓝色的为凋亡卵泡。随机从每个标本中取出3张切片，在随机选取的10个视野内对凋亡卵泡进行计数，计算凋亡百分比。TUNEL阳性率=TUNEL阳性细胞数(棕色信号)/总细胞数(蓝色)×100%，即卵泡凋亡率=卵泡凋亡数/总卵泡数×100%。

1.7 卵巢组织电镜检测

组织经固定、干燥、渗透与包埋、切片、染色等处理后制成电镜样本，用JEM-1400PLUS透射电镜对铜网进行图像采集，每张铜网于15 000、25 000倍下观察超微结构。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 SS31对冷冻卵巢的组织学特性影响

FRESH组(图1A)各级卵泡未见明显异常，间质细胞、颗粒细胞排列规则、紧密。CONTROL组(图1B)卵泡皱缩、塌陷，胞核固缩，卵母细胞形态不规则，颗粒细胞排列紊乱、稀疏，形态结构模糊，胞质部分溶解，透明带不规则，放射冠排列紊乱。5 μM-SS31组、10 μM-SS31组、20 μM-SS31组、40 μM-SS31组中(图1C～F)随着添加SS31浓度的升高，冷冻卵巢组织形态结构越趋于新鲜卵巢组织，其中40 μM-SS31组卵泡结构相对规则完整，卵泡数目较多，与FRESH组结构最为相近。见图1(彩插1)。

2.2 SS31对冷冻卵巢组织各级卵泡数量的影响

CONTROL组的原始卵泡、初级卵泡数目较FRESH组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；20 μM-SS31组、40 μM-SS31组中原始卵泡数量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。随着SS31浓度增加，FRESH组与40 μM-SS31组中初级卵泡数量的差异无统计学意义(P>0.05)。各组次级卵泡、窦状卵泡数目的差异无统计学意义(P>0.05)，见下页图2。

图2 各组不同时期卵泡个数的比较

2.3 SS31对冷冻卵巢各级卵泡数量占比的影响

各组卵巢组织中的原始卵泡占比最高，初级卵泡间占比的差异具有统计学意义(P<0.001)。各组原始卵泡占比、次级卵泡占比、窦状卵泡占比差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 各组卵巢组织中各级卵泡数量占比的比较

2.4 SS31对冷冻卵巢组织卵泡损伤率的影响

FRESH组卵泡损伤率最低(P<0.05)；随着SS31浓度的增加，卵泡损伤率降低(P<0.05)。各组卵泡损伤率的比较见图3。

图3 各组损伤卵泡占比的比较

2.5 SS31对冷冻卵巢组织卵泡凋亡的影响

TUNEL测定各组卵巢组织中卵母细胞凋亡情况如下图(图4A～F，彩插1)。FRESH组卵泡凋亡率平均百分比最低，CONTROL组最高，随着SS31浓度增加卵泡凋亡率平均百分比降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 各组卵泡凋亡百分比的比较

2.6 SS31对冷冻卵巢组织超微结构的影响

FRESH组细胞形态正常，各细胞器结构完整清晰，可见丰富的细胞器，其余冻融组见不同程度的细胞器形态改变。CONTROL组中线粒体数量显著减少，大量线粒体肿胀，甚至呈空泡状。5 μM-SS31组、10 μM-SS31组、20 μM-SS31组、40 μM-SS31组中，随着SS31浓度的增长，线粒体肿胀程度减轻，数量增多，见下页图6。

图6 卵巢组织电镜观察

3 讨论

卵巢组织冷冻常用的方法有慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻。迄今为止，全球通过卵巢组织冷冻和移植技术出生的婴儿已超过200例[9]，其中大多数采用慢速程序化冷冻，通过移植玻璃化冷冻保存的人卵巢组织获得的活产婴儿不超过5个[10]。慢速程序化冷冻所需冷冻保护剂少，细胞毒性小，但所需设备昂贵，耗时长，步骤繁琐，冷冻过程易产生冰晶造成细胞损伤，因此临床应用受到限制。反之，玻璃化冷冻方法简便易行，不需要昂贵的仪器设备，但冷冻过程应用高浓度的冷冻保护剂可能存在潜在的细胞毒性。因此何种方法更具优势仍有争议，一些研究认为慢速程序化冷冻在保存原始卵泡方面更优于玻璃化冷冻[11-12]。但更多的研究认为玻璃化冷冻和慢速程序化冷冻之间没有显著差异[13-15]，甚至玻璃化冷冻还更优于慢速程序化冷冻[16]，能更好地保存卵泡形态[17-18]。

冷冻保存的卵巢组织在合适的时机经解冻复苏后移植回女性体内，冻融卵巢组织中存活的卵泡数量对移植后卵巢组织生殖内分泌功能的恢复具有重要影响。卵巢在冷冻复苏过程中不可避免地面临卵泡损伤、细胞凋亡，如何减少冻融后卵巢组织中卵泡的损伤，提高冷冻保存的有效率成为改进生育力保存技术的关键问题之一。研究认为卵泡凋亡的根本原因与线粒体氧化损伤和ROS水平升高有关[19]。当卵泡遭受缺血、缺氧、氧化应激时，线粒体释放大量ROS，细胞通透性增加，大量凋亡因子释放，卵泡细胞损伤凋亡[20]。线粒体靶向抗氧化剂SS31可以靶向定位和聚集于产生ROS的场所——线粒体内膜，减少线粒体ROS的产生，减少细胞凋亡[21]。与其他抗氧化剂不同，SS31可以不依赖膜转运蛋白及受体自由渗透细胞，穿越线粒体膜，SS31摄取不受线粒体电位的驱动，甚至可以被去极化的线粒体摄取[22]。由于其抗氧化、抗凋亡特性，SS31在阿尔茨海默氏病[23]、帕金森氏病[24]、动脉粥样硬化[25]、缺血再灌注损伤[26]、阻塞性肾病[27]等方面的研究均显示具有积极作用。本实验研究SS31对于卵巢组织冷冻复苏的影响。

本试验在卵巢组织冷冻复苏液中分别添加5 μM SS31、10 μM SS31、20 μM SS31、40 μM SS31。在HE染色中观察到，随着添加SS31浓度的升高，卵巢组织学形态变化可见一定改善，当SS31浓度达40 μM时差异最显著。与此同时，本试验中各组卵巢组织中原始卵泡数量最多，占比最大，一方面可能与它本身数量庞大有关，另一方面由于原始卵泡体积小，代谢低，对于缺血缺氧的耐受力更强，更不易受冷冻复苏的影响。各组中次级卵泡和窦卵泡数目的差异无统计学意义，这可能由于卵巢组织冷冻保存时，组织中不同类型的细胞对降温和复苏速率及冷冻保护剂的浓度有不同需求，从而导致影响程度不同。尽管对于次级卵泡和窦卵泡数量的影响并不显著，但仍然反映了在目前的技术条件下，冷冻损伤难以避免。而如何避免冷冻损伤，目前还没有最优的玻璃化冷冻方案。下一步还需要通过反复建立卵巢组织冷冻的模型来进一步探讨不同冷冻方案的效果。

TUNEL检测中，新鲜卵巢组织虽未经冷冻复苏过程，但由于卵巢离体后的缺血缺氧和氧化应激损伤，也呈现一定程度的细胞凋亡。冻融卵巢组织随着SS31浓度的增加，卵泡损伤率、卵泡凋亡率下降，差异具有统计学意义，说明SS31在卵巢组织冷冻复苏过程中可能具有降低卵泡凋亡、提高卵泡存活率的作用。

不同发育阶段的卵泡是由多个细胞器构成，包括线粒体、内质网、高尔基体等，这些细胞器具有不同功能，是细胞代谢和细胞活力的形态支柱。其中，线粒体作为一个重要的细胞器，其完整的形态是维持功能的前提。研究显示，SS31可抑制线粒体膜通透性的改变和线粒体膜电位的降低，防止线粒体肿胀[28]。同时，SS31还可以快速干预老龄小鼠骨骼肌线粒体能量代谢状态，增强线粒体功能[29]。基于SS31对其他器官和组织线粒体结构和功能的改善作用，在本试验中，我们利用透射电镜技术观察组织超微结构发现，不含SS31的CONTROL组中线粒体数量显著减少，大量线粒体肿胀，甚至呈空泡状，随着SS31浓度的增长，线粒体肿胀程度逐渐减轻，数量逐渐增多，当SS31浓度达40 μM时这种改善最为明显。遗憾的是，在本实验中，对于线粒体功能的改善情况未进行测定，需要后续实验进一步验证。

本实验结果表明SS31可减轻冻融家兔卵巢组织中卵泡的损伤，对于玻璃化冷冻和复苏过程具有一定的保护作用。但本研究还存在一定的局限性，例如SS31的浓度梯度设置较小，未探究到最佳干预浓度，我们将在下一步实验中探究SS31的最佳干预浓度和其作用机制。