线粒体质量控制系统与脓毒性心肌病发病机制相关性的研究进展

陈 德， 梁 譞， 牛小伟， 刘 健

脓毒性心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy, SIC)作为脓毒症最严重的并发症，主要临床特征为左心室扩张、心室收缩功能和舒张功能抑制，研究发现，40%以上的ICU脓毒症患者会合并心肌功能障碍[1]，增加了脏器衰竭和死亡风险[2]。线粒体在心肌细胞中含量丰富，对维持心脏功能和心肌细胞生存具有重要意义，线粒体损伤和功能障碍会引发心脏功能异常。线粒体质量控制系统(mitochondria quality control, MQC)是真核生物维持机体线粒体稳态的重要机制,其包括线粒体生物发生、融合/分裂、自噬三个方面。线粒体生成与线粒体自噬可以调控线粒体更新与降解，线粒体融合/分裂是线粒体修复的重要环节，三者协同完成线粒体数量和质量的双重调控。研究SIC心肌细胞MQC变化机制并采取相应的靶点治疗，对改善SIC具有重要意义。现针对MQC在SIC相关研究进展进行综述。

1 MQC

1.1线粒体生物发生

线粒体生物发生是指原有线粒体在核DNA(nDNA)及线粒体DNA(mtDNA)双重调控下，通过生长和分裂的方式产生新线粒体以替代功能失调及损伤的线粒体，从而维持线粒体结构、功能和数量的稳定。线粒体生物发生的过程包括线粒体双膜的合成、nDNA编码的线粒体蛋白的合成与输入、mtDNA的复制及其编码的线粒体蛋白的合成[3]。不同生理性及病理性应激刺激均可促使线粒体生物发生，如运动训练、低温、电刺激、热量限制、氧化还原失衡、细胞增殖和分化等。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α, PGC-1α) 是线粒体生物发生的中枢调控因子,其主要上游信号调节因子包括沉默信息调节因子1(silent information regulator 1, SIRT1)和SIRT3、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK),下游信号调节因子包括核因子1 和2 (nuclear respiratory factors 1/2, NRF1/2)。当线粒体生物生成时，PGC-1α可被AMPK及SIRT1通过磷酸化作用和去乙酰化修饰直接激活，再作用于下游的核呼吸因子 NRF1 和 NRF2，通过蛋白质相互作用提高NRF1和NRF2的表达和活性，后两者激活线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)并结合到呼吸链复合体亚基的启动区域，从而上调mtDNA的复制和转录。

1.2线粒体动力学

线粒体融合与分裂的动态循环过程称为线粒体动力学，融合与分裂之间的动态平衡需要由相关动力蛋白维持,多种诱导因子可通过调节相关蛋白表达及活性导致线粒体动力学失衡,进而影响线粒体结构和功能。当机体内细胞能量产生不足,或者两独立线粒体存在不同缺陷,线粒体可通过融合的方式强化氧化磷酸化作用，以提供细胞生命活动所需的能量,也可加速受损mtDNA的修复,保持其完整性。作为融合的反过程，线粒体分裂可使受损的mtDNA和电位下降的线粒体膜分配到一个子线粒体中,依靠泛素-蛋白酶途径或后续自噬作用降解,进而维持线粒体正常的生理功能。Kleele等[4]研究发现，两种空间不同的线粒体分裂类型，即中区分裂和外周分裂，不同的区域分裂模式预示了子线粒体不同的结局。应激损伤状态下，线粒体通过外周分裂之后产生大小不一的子线粒体，其中缺乏mtDNA的较小子线粒体被线粒体自噬，而较大的子线粒体得以保留。在细胞生长和细胞分裂的活跃期或存在较高能量需求时，主要进行的是中间分裂，如心肌细胞内线粒体较多进行中间区分裂，此种分裂方式前后的线粒体生理状态并无明显差异。

线粒体融合受到外膜蛋白包括线粒体融合蛋白1(mitofusin1/2, Mfn1/2)、线粒体磷脂酶D(mitochondrial phospholipase D, MitoPLD)，以及内膜蛋白包括视神经萎缩因子1(opticatrophy 1, Opa1)等精确调控。Mfn1和Mfn2依赖二聚化介导外膜融合，有研究[5]显示，异源二聚体(Mfn1-Mfn2)融合效率不低于两者的同源二聚体,提示Mfn1-Mfn2可能在融合过程中发挥重要功能。Opa1具有多种异构体(8种不同的剪接变体)，主要分为锚定在内膜上长(L-)和可溶的短(S-)两种活性异构体。L-Opa1在延长/融合活性中起重要作用，而S-Opa1在线粒体能量学和嵴维持中起关键作用。在L-Opa1与S-Opa1共同作用下，线粒体内膜融合得以正常进行。在应激因素下，L-Opa1可被蛋白酶如OMA1和YME1L全部剪切为S-Opa1，线粒体融合过程会受到抑制[6]。介导线粒体分裂的关键效应因子是动力蛋白相关蛋白-1(dynamin-related protein1, Drp-1，也称为DNM1L),其通过受体蛋白包括线粒体分裂蛋白1(fission protein 1, Fis1)、线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor, Mff)、线粒体动力蛋白49(mitochondrial dynamics proteins 49, MiD49) 及 MiD51招募在线粒体外膜形成螺旋寡聚体,环状包裹线粒体外膜并将线粒体分裂。有学者提出, Drp1不足以进行线粒体裂变,另一种称为动力蛋白-2(dynamin-2, DNM2)的GTP酶是可能分裂复合物的重要构成部分。但一项新的研究[7]表明,仅敲降DNM2的细胞没有表现出线粒体裂变障碍或过度融合,但在敲降Drp1后可导致上述缺陷。

1.3线粒体自噬

线粒体自噬是有选择将受损或功能失调的线粒体在溶酶体内进行降解，适时有效清除损伤的线粒体对维持细胞生理和器官稳态至关重要。线粒体自噬主要通过以下两种公认的介导途径:PTEN 诱导的激酶1 (PTEN induced putative kinase 1, PINK1)-E3泛素连接酶Parkin介导的泛素依赖经典途径；第二种是不依赖泛素的线粒体受体蛋白介导途径。生理条件下，PINK1进入线粒体内膜会被线粒体内膜蛋白酶(presenilin-associated rhomboid-like protein， PARL)识别并剪切，之后被蛋白酶体降解，而在膜电位降低的受损线粒体中，PINK1稳定积累在线粒体外膜上并发生自体磷酸化，随之磷酸化泛素(ubiquitin, Ub)的丝氨酸位点(Ser65)，磷酸化的Ub募集Parkin至线粒体上，PINK1通过磷酸化Parkin Ubl区的Ser65激活其活性，促进多种线粒体外膜蛋白泛素化，吸引选择性可溶性自噬受体NDP52、OPTN和p62，进而诱导受损线粒体与自噬体膜蛋白-微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein1A/1B-light chain 3, LC3)结合，最终启动自噬程序降解被泛素化标记的线粒体。不依赖泛素的线粒体受体蛋白介导线粒体自噬的过程一般认为由线粒体受体蛋白和LC3/A型γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)受体相关蛋白(GABA type A receptor-associated protein, GABARAP)家族蛋白之间的相互作用实现。参与线粒体自噬的线粒体受体蛋白主要包括BNIP3L/NIX、FUNDC1、BNIP3、FKBP8PHB2和AMBRA1等[8]，在不同的应激诱导下，通过LC3互作区域(LC3-interacting region, LIR)锚定自噬泡上的LC3及GABARAP，诱导线粒体自噬发生，完成靶向清除功能。

此外，线粒体内膜蛋白与线粒体脂质(如心磷脂)参与线粒体自噬调控。研究发现，当线粒体膜电位去极化和蛋白酶依赖性外膜破裂时，抗增殖蛋白2(prohibitin 2, PHB2)作为一种线粒体内膜自噬受体可通过LIR结合LC3并介导PINK1-Parkin依赖性的线粒体自噬。针对PHB2参与PINK1-Parkin途径调控机制，最近的研究[9]表明，PHB2可稳定PARL并抑制其对于PGAM5的剪切，PGAM5可将PINK1稳定在线粒体外膜上，促进线粒体自噬的分解代谢过程进行。

2 MQC与SIC的发生

2.1线粒体生物发生与SIC

有研究[10-11]证明，线粒体生物发生的增加可以改善脓毒症的预后，生物发生的抑制可以增加死亡率。Liang等[12]研究发现，脓毒症小鼠心肌细胞线粒体出现肿胀、ATP含量降低、线粒体生物发生增加，经治疗后线粒体肿胀减轻、ATP含量增加，线粒体发生进一步增加，证明线粒体生物生成可以改善脓毒症引起的线粒体功能障碍，减轻脓毒症心肌损伤。Kokkinaki 等[13]采用盲肠结扎穿孔术(CLP)方式制作腹腔感染的脓毒症小鼠模型，术后4 h观察发现心功能受损，术后12 h从小鼠中分离出心肌细胞，观察发现线粒体 DNA 拷贝数大幅下降，包括PGC-1α和PGC-1β在内的线粒体生物发生标志物的心脏基因表达减少，而TFAM没有显著变化。Schilling等[14]研究显示，当给小鼠注射脂多糖(LPS)时，PGC-1共激活因子(即PGC-1α其及异物体PGC-1β )很容易被抑制，导致心肌细胞代谢紊乱，从而降低心室功能。Huang等[15]首次在临床中应用ELISA法检测196例ICU患者的血清MQC相关生物标志物水平，结果显示，脓毒症休克组血清PGC-1α水平较非脓毒症休克组显著下降，表明上述蛋白血清水平与脓毒症患者器官功能显著相关，在一定程度上能反映MQC状态，进一步验证了在脓毒症动物模型中的观察结果。然而，过多的生物发生似乎会加重线粒体功能异常,一项研究[16]证明，PCG1-α过表达导致生物发生的过量，并导致心力衰竭。

去乙酰化酶Sirtuins家族蛋白在脓毒症研究中得到广泛关注，Xu等[17]研究发现，SIRT3的缺失导致心脏三羧酸(TCA)循环中关键酶的乙酰化上调，乳酸及NADH的产生显著增加，促进线粒体功能障碍，加重脓毒症后心功能不全。研究[18]报道，SIRT3下调和AMPK失活是脓毒症诱导心肌损伤进展的主要亚细胞事件，SIRT3表达下调抑制了AMPK活性，导致线粒体生物发生受阻，随后表现为线粒体代谢下降，线粒体ROS产生增加，线粒体凋亡增加，而SIRT3 过表达可增加 AMPK 活性并改善线粒体生物发生，从而维持线粒体功能并减少与脓毒症相关的心肌细胞损伤。NRF-2是一种关键的抗氧化核心转录因子,通过调节一系列抗氧化酶的转录发挥作用，转录因子 NRF-1通过调节TFAM,在调控线粒体生物发生中发挥关键作用。文献[19]报道,NRF-2对NRF-1的转录、线粒体生物发生及心肌保护有一定调控作用。NRF-2敲低抑制PGC-1α下调的线粒体生物发生[20]，而PGC-1α增强NRF-2介导的抗氧化反应[21]，NRF-2通过与PGC-1α相互作用调节线粒体的生物发生。

2.2线粒体动力学与SIC 早期机体遭受应激因素时，首先触发线粒体分裂和融合的适应性变化，即通过融合进行功能代偿，当线粒体损伤过度时，线粒体分裂增加，随后启动自噬机制进行再循环[22]。虽然生理条件下分裂是线粒体质量控制所必需的，但过度的线粒体分裂将导致线粒体功能下降和氧化应激增加[23-24]。众多研究[25]证实，过量NO、ROS产生和积累对人体各种组织线粒体产生损伤效应，包括心肌组织。现已证明，脓毒症时心肌细胞活性氧和活性氮自由基的生成明显增加，同时线粒体动力学发生了显著变化，而由ROS/RNS诱发的融合/分裂异常在脓毒症的病情进展中可能起重要作用[26]。相关报道[27]显示，氧化应激可导致线粒体分裂增加。其次，脓毒症时对线粒体动力学的影响也表现在线粒体动态平衡调节蛋白的异常表达。研究[28]表明，脓毒症期间线粒体动力学平衡向线粒体分裂增加转变，这反映在Mfn2和Opa1的降低， 磷酸化Drp1表达上升。Sánchez-Villamil等[29]应用CLP建立小鼠脓毒症模型，术后24 h观察发现，线粒体嵴超微结构发生改变，同时伴随Opa1表达降低和Drp1过度激活，提示线粒体融合/分裂失衡。亦有研究[30-31]表明，这种线粒体动力学改变介导的脓毒症心肌损伤与Drpl磷酸化表达增加有关，而Mfn2表达却无显著变化。Haileselassie等[32]在LPS诱导小鼠SIC模型中发现，LPS诱导的线粒体动力学改变依赖于活化Drp1介导的线粒体分裂过程,同时通过抑制Fis1可降低线粒体氧化应激并改善线粒体膜电位，提示Fis1/Drp1依赖途径在脓毒症诱导的线粒体功能障碍中发挥重要的作用。

2.3线粒体自噬与SIC 越来越多的证据表明，线粒体自噬激活通过发挥抗炎效应保护心肌细胞免受致命炎性反应的损伤，因为炎症失控是心肌病发病机制有关的主要因素。有研究[33]表明，在 LPS 诱导的小鼠急性肺损伤模型中，电子显微镜图像证实，LPS 诱导的线粒体自噬增加，研究发现，Parkin 从细胞质募集到线粒体，LPS 通过 PINK1/Parkin途径激活线粒体自噬，Bcl-2 家族蛋白(包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w和Bim)的参与并强化了LPS 处理期间PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬。Shang等[34]在一项LPS诱导的小鼠SIC模型中研究发现,Mst1表达显著上调，敲除Mst1可减弱LPS介导的炎症损伤，通过抑制Parkin介导线粒体自噬削弱了Mst1缺失对线粒体稳态和心肌细胞活力的保护作用，证明SIC与Mst1上调有关，随后保护性线粒体自噬下降。Fundc1介导的线粒体自噬通过干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)途径与炎症密切相关[35]，从而提示其在SIC中的潜在作用。Jiang等[36]研究显示, LPS刺激的H9C2心肌细胞Fundc1水平降低，Fundc1相关的线粒体自噬被抑制。LC3BⅡ是自噬体形成的已知标志物，Kokkinaki 等[13]在CLP诱发小鼠脓毒症中发现，Map1lc3b和BNIP3 mRNA表达上调，通过对LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化测定发现，LC3BⅡ/LC3BⅠ比值增加，证明了从脓毒症小鼠心肌组织中线粒体自噬途径被激活。Cao等[37]采用LPS腹腔注射及1 μg/mL浓度刺激构建脓毒症诱发心功能障碍的小鼠及HL-1细胞模型,结果表明，caspase-3通过剪切Beclin-1抑制LPS诱导的线粒体自噬，并促进ROS的释放，导致线粒体损伤。解耦联蛋白 2(UCP2)作为线粒体内膜重要因子，在脓毒症期间表达上调并对心血管疾病具有保护作用，并且 UCP2 缺乏已被证明会加重 UCP2 敲除小鼠和心肌细胞的SIC[38-39],进一步探讨UCP2可能通过AMPK介导的促进自噬来调节线粒体功能，从而有助于维持心肌细胞活性[40]。

3 调控MQC与SIC的治疗

3.1调控线粒体生成与SIC的治疗 鉴于PGC-1α在线粒体生物合成过程中核心作用，针对脓毒症心肌线粒体生物发生干预策略主要集中以PGC-1α为靶点的研究。研究[41]表明，PGC-1α过表达慢病毒转染H9C2细胞可有效激活线粒体生物合成和自噬功能，以减轻LPS诱导的心肌细胞线粒体损伤，但通过ZLN005(PGC-1α激活剂)，激活PGC-1α并没有改善疾病预后、病理及线粒体损伤,一方面考虑可能单一使用PGC-1α激动剂治疗在短期内无效，此外可能该药对心肌组织的局部影响可能并不显著。另一项研究[42]表明，氢气吸入治疗增加CLP脓毒症小鼠线粒体功能(MMP、ATP水平、复合物Ⅰ活性)和线粒体生物发生因子(PGC-1α、NRF2、TFAM)的表达。然而，注射SR-18292(PGC-1α抑制剂)可降低线粒体功能、PGC-1α活化，以及NRF2和TFAM的表达，结果表明，氢气通过激活PGC-1α，增加线粒体生物发生，减轻脓毒症诱导的小鼠脑损伤。关于准噶尔乌头碱在脓毒症期间心脏保护效应机制研究[43]显示，NRF-2与PGC-1α协同作用介导了线粒体的生物发生，准噶尔乌头碱可促进Keap1降解，进而激活NRF-2，并通过调节NRF-2/ARE和PGC-1α级联反应可保护心脏功能。SIRT3是主要的线粒体Sirtuin成员(仅SIRT3、SIRT4和SIRT5定位于线粒体)，有研究[17]验证，大黄素作为SIRT3调节剂，通过下调心肌乙酰化及促进ATP产生来改善脓毒症心肌损伤，表明SIRT3可作为治疗SIC的潜在靶点。

3.2调控线粒体动力学与SIC的治疗 研究[13]报道，CLP小鼠脓毒症心脏组织Mfn1、Mfn2和Drp-1的mRNA水平升高，Fis-1的mRNA水平有降低趋势，通过LGM2605(一种化学合成的抗氧化剂)处理后恢复了CLP介导的Mfn-1、Mfn-2、Drp-1和Fis-1表达变化，表明LGM2605可能通过抑制CLP小鼠中诱导的相关动力蛋白改变来影响线粒体融合和分裂之间的动力学。强力霉素作为一种四环素家族的抗生素，有证据[27]表明，其可减少氧化应激诱导H9C2心肌细胞线粒体的断裂和去极化，并有利改变 Mfn-2、OPA-1 和 Drp-1的表达，从而防止线粒体断裂并提高细胞存活率。Mdivi-1具有选择性抑制Drp-1的作用，研究[28]证实，Mdivi-1通过抑制线粒体分裂增加,主要表现线粒体Mfn-2、Opa-1表达增加，磷酸化Drp-1减少，对脓毒症时线粒体功能维持具有显著作用。有实验团队研发了阻断Drp-1/Fis-1及Drp-1/MFF在线粒体相互作用的新型特异性抑制剂P110、P259，并在脓毒症心肌细胞模型中证明P110通过抑制Drp-1/Fis-1相互作用可减轻线粒体异常分裂和功能障碍[32]。去氧肾上腺素是α1肾上腺素能受体(α1-AR)特异性激动剂，研究[44]报道，其通过激活PI3K/Akt信号途径上调融合相关蛋白(Mfn1、Mfn2和Opa-1)和下调裂变相关蛋白(Fis-1和Drp-1)来保持线粒体动力学平衡,从而显著改善脓毒症大鼠心功能障碍。

3.3调控线粒体自噬与SIC的治疗 生脉注射液(SMI)是由红参、麦冬和五味子组成的经典中药复方制剂，近期一项研究[37]证明，与SIC小鼠模型组相比，SMI 组PINK1、Parkin蛋白表达，以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值显著增加，同时发现，线粒体膜电位升高、ROS含量降低，进一步研究表明，SMI可能通过抑制caspase-3对Beclin-1的裂解，促进心肌线粒体自噬，从而改善SIC心肌线粒体损伤。RhoA/ROCK信号异常活化，在多种心血管疾病发病机制中的作用得到证实，研究[30]发现，法舒地尔可有效改善LPS刺激诱导的心脏炎症、氧化应激、细胞骨架紊乱和线粒体损伤，这可能归因于法舒地尔通过抑制ROCK而增加LC-3Ⅱ转化、SQSTM1/p62蛋白表达和自噬体数量，启动并上调自噬水平,最终增强受损线粒体的降解清除。在一项LPS刺激H9C2 细胞建立的SIC体外模型中发现[36]，鸢尾素可增加Fundc1 蛋白水平表达，并增强Fundc1介导的线粒体自噬，从而增加心肌细胞 ATP 产生，增强其抗氧化能力并减少细胞凋亡，这表明鸢尾素是一种潜在SIC治疗药物。

4 总结与展望

体内外实验模型展开的研究结果均证实，MQC异常所致线粒体形态及功能改变是SIC发生和发展的重要机制之一。目前，线粒体生物发生、融合/分裂、自噬的异常在脓毒症及SIC中的地位日益受到重视并取得了一些进展，但MQC是一个多因素参与调控的生理过程，具体过程及机制仍存在一定的认知限制，尤其是三者之间的相互调控途径及作用效应，其潜在机制仍有待进一步破译。特异性靶向调节MQC来改善SIC的治疗策略已有陆续报道，如促进线粒体生物合成、维持线粒体动力学平衡、增强线粒体自噬等干预措施，上述研究主要集中在细胞及动物实验水平上相关调控分子的激动剂、抑制剂或基因表达调节的应用，相应的临床研究开展较少。需强调的是，维持MQC的整体平衡比单独改变某一独立过程可能在预防或改善SIC进展中更为重要。总而言之，针对MQC领域进行深入研究有利于揭示SIC的病理机制，为SIC治疗提供新的靶标及治疗策略，从而有助于此类疾病的有效防治和临床结局的最终改善。