葛根芩连汤调控微RNA-542-3p对溃疡性结肠炎的保护机制

龚竹韵 杨晓丹 程 序 孙怀艳 高 翔

(1 安徽中医药大学第二附属医院药剂科,合肥,230061; 2 中国科学技术大学附属第一医院药剂科,合肥,230001)

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)是直肠和结肠发生的一种原因未明的炎症性疾病,肠道炎症介质水平升高。临床主要表现为腹泻、腹痛、血便等[1]。虽然其病因尚不十分明确,但普遍认其发病与免疫、遗传、环境及肠道感染等多因素有关[2]。葛根芩连汤源于《伤寒论》,为中医方剂名,可以调节人体的内分泌系统,有助于控制血糖含量,预防心血管疾病,还可以消除体内炎症,降低肠炎因子,能够改善肠道菌群,减轻细菌性痢疾[3-4]。miR-542-3p是一种微RNA(microRNA,miRNA/miR),参与机体多种疾病的调节,尤其是在结直肠疾病中发挥重要作用。有研究表明。miR-542-3p在结直肠癌患者中表达量降低,在结直肠癌的发生发展过程中起抑制作用,可作为诊断结直肠癌的生物学标志物[5]。过表达miR-542-3p,可以抑制结直肠癌细胞侵袭转移能力[6]。本实验主要探讨葛根芩连汤调控miR-542-3p表达对UC大鼠的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取160只8～10周龄SD大鼠,体质量(200±10)g,购自安徽医科大学实验动物中心,许可证编号SCXK(皖)2021-009,为排除性别因素影响,本研究均采用雄性SD大鼠。21～25 ℃温度,40%～70%相对湿度,通风环境,标准饲料喂养。本研究动物组织处理经安徽中医药大学第二附属医院动物伦理委员会审核批准(伦理审批号:AHZYYDXTCM21211945)。

1.1.2 药物 葛根、黄连、黄芩、甘草购自安徽中医药大学第二附属医院中药房,批号分别为2020625、20200821、20210209、20211225。葛根芩连汤由葛根150 g、黄连90 g、黄芩90 g、炙甘草60 g制备,葛根芩连汤用临床方法煎煮:加入8倍体积的水量,浸泡30 min,加热沸腾,保持微沸40 min,回流提取,低温减压浓缩至650 mL,药液浓度为0.6 g/mL,每日按此剂量煎煮1次用于灌胃。美沙拉嗪胶囊购自葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司,批号:201124。

1.1.3 试剂与仪器 酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)试剂盒:肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司,货号:SP12250),白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)试剂盒(上海初态生物科技有限公司,货号:CT9077),白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)试剂盒(上海初态生物科技有限公司,货号:CT9082)；化学比色检测试剂盒:丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒(深圳子科生物科技有限公司,货号:ZK-L3236),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD试剂盒(深圳子科生物科技有限公司,货号:GMS70042),谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)试剂盒(深圳子科生物科技有限公司,货号:ZK-L3218)；Lipofectamine® 3000转染试剂(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：L3000150)Trizol试剂盒(碧云天生物技术有限公司,货号R0016)；逆转录试剂盒(上海初态生物科技有限公司,货号:CT670730)；TB Green Fast qPCR Mix荧光定量qPCR试剂盒400 Rxns(Takara公司,日本,货号:Takara.RR430B)。酶标仪(Thermo公司,美国,型号:MK3);实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)分析仪(博日科技股份有限公司,LineGene Mini,型号:FQD-16B)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 大鼠禁食24 h,腹腔注射10 mL/kg的3%戊巴比妥钠麻醉,用聚丙烯管插入肛门上段约8 cm处,第1天,注入0.04 mmol/L的二硝基氯苯(Dinitrochlorobenzene,DNCB)乙醇溶液0.25 mL,注射2 d。第3天注入8%的乙酸溶液2 mL,15 s后用生理盐水冲洗,观察结肠组织病理变化,确定UC造模成功。同批次等体质量健康大鼠16只作为空白对照组。造模成功后的大鼠，根据大鼠体质量做区间随机化分组，各组大鼠之间的体质量差异无统计学意义(P>0.05)，分成模型组、美沙拉嗪组、葛根芩连汤低剂量、中剂量、高剂量组，每组16只。空白对照组:正常大鼠20 mL/(kg·d)生理盐水灌胃；模型组:大鼠UC模型及等体积生理盐水灌胃、美沙拉嗪组:10 mg/(kg·d)美沙拉嗪灌胃、低剂量组：5 mL/(kg·d)葛根芩连汤灌胃、中剂量组：10 mL/(kg·d)葛根芩连汤灌胃、高剂量组：20 mL/(kg·d)葛根芩连汤灌胃,连续给药1周。对UC大鼠进行安乐死，分离溃疡段结肠，使用眼科剪刀剪碎，加入0.1% I型胶原酶37 ℃消化30 min，分离获得大鼠结肠上皮细胞。大鼠结肠上皮细胞用含10%的胎牛血清的DMEM培养基培养。UC结肠细胞进入对数生长期后消化传代至24孔板培养，每孔加入2×105个细胞。贴壁过夜后，用Lipofectamine® 3000将miR-NC、miR-542-3p、anti-miR-NC、anti-miR-542-3p质粒转染至对数生长期的UC结肠上皮细胞，根据转染质粒的不同分成miR-NC组、miR-542-3p组、anti-miR-NC组及anti-miR-542-3p组。其中miR-NC、miR-542-3p组经含10%生理盐水处理24 h，anti-miR-NC、anti-miR-542-3p组经含10%葛根芩连汤DMEM培养基处理24 h，处理结束后分析细胞上清液炎症介质和氧化应激相关指标的变化。实验重复3次，每次实验细胞来源于同一只UC大鼠。

1.2.2 给药方法 空白对照组:同剂量生理盐水灌胃、模型组:构建大鼠UC模型、美沙拉嗪组:10 mg/(kg·d)灌胃、葛根芩连汤低剂量组5 mL/(kg·d)灌胃、中剂量组10 mL/(kg·d)灌胃、高剂量组20 mL/(kg·d)灌胃组,药物处理持续1周。将miR-NC、miR-542-3p转染至UC大鼠的结肠细胞,作为UC+miR-NC、UC+miR-542-3p组;将anti-miR-NC、anti-miR-542-3p转染至UC大鼠的结肠细胞,再用葛根芩连汤处理,作为UC+anti-miR-NC+葛根芩连汤组、UC+anti-miR-542-3p+葛根芩连汤组。

1.2.3 检测指标及方法

1.2.3.1 ELISA检测大鼠结肠组织和细胞炎症介质含量 提取大鼠结肠组织和细胞中的上清液,按照ELISA试剂盒说明书中介绍的实验步骤,检测TNF-α、IL-6、IL-8含量。

1.2.3.2 化学比色法检测大鼠结肠组织和细胞氧化应激指标水平 提取大鼠结肠组织和细胞中的上清液,采用化学比色法,并根据MDA、SOD、GSH-Px试剂盒的具体方法进行操作。

1.2.3.3 RT-qPCR检测大鼠结肠组织和细胞miR-542-3p表达水平 根据Trizol试剂盒的要求进行实验步骤,提取组织和细胞中的总RNA,将RNA反转录为目的基因cDNA。以目的基因cDNA为模板,进行RT-PCR实验。PCR扩增条件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环。miR-542-3p以U6为内参,2-△△Ct法计算miR-542-3p相对表达水平。miR-542-3p上游引物5′-TGTGACAGATTGATAAC-3′,下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′,下游引物5′-AATATGGAACGCTTCACGAAT-3′。

2 结果

2.1 葛根芩连汤对UC大鼠结肠组织炎症介质的影响 与空白对照组比较,模型组炎症介质TNF-α、IL-6、IL-8含量明显增加(P<0.05);与模型组比较,葛根芩连汤中、高剂量组炎症介质TNF-α、IL-6、IL-8含量显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 葛根芩连汤对UC大鼠结肠组织炎症介质的影响

2.2 葛根芩连汤对UC大鼠结肠组织氧化应激指标的影响 与空白对照组比较,模型组MDA水平明显上调,SOD、GSH-Px水平明显下调(P<0.05);与模型组比较,葛根芩连汤中剂量、高剂量组MDA水平显著降低,SOD、GSH-Px水平显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 葛根芩连汤对UC大鼠结肠组织氧化应激指标的影响

2.3 葛根芩连汤对UC大鼠结肠组织miR-542-3p表达的影响 与空白对照组组比较,模型组miR-542-3p表达水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,葛根芩连汤中剂量、高剂量组miR-542-3p表达水平显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 葛根芩连汤对UC大鼠结肠组织miR-542-3p表达水平的影响

2.4 过表达miR-542-3p对UC大鼠结肠细胞炎症介质和氧化应激的影响 与UC+miR-NC组比较,UC+miR-542-3p组细胞miR-542-3p表达水平显著升高;TNF-α、IL-6、IL-8含量显著降低;MDA水平显著降低以及SOD、GSH-Px水平显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 过表达miR-542-3p对UC大鼠结肠细胞炎症介质和氧化应激的影响

2.5 抑制miR-542-3p逆转葛根芩连汤对UC大鼠结肠细胞炎症介质和氧化应激的影响 与UC+anti-miR-NC+葛根芩连汤组比较,UC+anti-miR-542-3p+葛根芩连汤组细胞miR-542-3p表达水平显著降低;TNF-α、IL-6、IL-8含量显著升高;MDA水平显著升高以及SOD、GSH-Px水平显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 抑制miR-542-3p逆转葛根芩连汤对UC大鼠结肠细胞炎症介质和氧化应激的影响

3 讨论

UC是一种炎症性肠病,会在结肠的内壁引起刺激、炎症和溃疡[7]。临床上直肠与乙状结肠先产生病变,然后病变蔓延到结肠,最终累及全结肠发生炎症,UC的特点是肠黏膜水肿、广泛充血,最后糜烂出血,严重影响患者的健康和生命质量,给患者带来痛苦,所以及时治疗非常重要[8]。UC的发病机制与肠道菌群失调、结肠黏膜屏障损伤及机体免疫功能紊乱密切相关[9]。其实这些都是相互作用的,菌群失调导致结肠黏膜失去保护,引起损伤后机体炎症水平上升进一步导致结肠炎加重。炎症常伴随氧化应激的产生,黄岑汤通过抗氧化应激保护UC[10]。大量实验结果表明中药/复方对UC具有显著的治疗效果。黄连解毒汤通过抑制核因子κB(Nuclear Factor Kappa-B,NF-κB)信号通路,激活核因子E2相关因子2(Nuclear Factor E2-related Factor 2,Nrf-2)信号通路,抑制炎症和氧化应激来保护肠黏膜，达到治疗效果[9]。热化湿祛瘀方通过调节氧化应激、改善结肠上皮细胞凋亡对UC具有一定的改善作用[11]。葛根芩连汤在临床上不仅具有清热解毒、泻火益气的作用。而且对胃肠炎也具有较好的效果,对UC小鼠肠黏膜上皮屏障功能有修复效果[12],改善Th17/Treg平衡改善UC病理损伤[13],通过下调炎症介质表达改善立UC相关结肠癌小鼠病理情况[14],对急性肠炎也有明显的改善效果[15]。本实验研究表明,与模型组比较,葛根芩连汤中、高剂量组TNF-α、IL-6、IL-8含量显著降低;MDA水平显著降低,SOD、GSH-Px水平显著升高,与之前研究结果一致。

近几年,已经有很多研究结果显示,miRNA参与UC的发生发展,并且通过中药联合miRNA探索中药治疗结肠炎的机制研究。柚皮素通过miR-22抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)炎症小体并减轻UC大鼠模型肠屏障损伤[16]。清肠温中方通过miR-675-5p/VDR(维生素D受体)信号通路调控UC的Th17/Treg免疫平衡及肠黏膜屏障[17]。复方芩柏颗粒剂通过靶向干预miR-199-3p改善UC的损伤[18]。在UC大鼠模型中,miR-542-3p相对表达量降低,过表达miR-542-3p可减轻结肠组织炎症反应，对UC大鼠有一定保护作用[19]。本实验通过探索葛根芩连汤与miR-542-3p对UC大鼠的改善机制研究,发现,模型组大鼠miR-542-3p表达显著降低,葛根芩连汤中剂量、高剂量组miR-542-3p表达水平显著升高,miR-542-3p过表达后,UC大鼠的TNF-α、IL-6、IL-8含量显著降低;MDA水平显著降低以及SOD、GSH-Px水平显著升高。

综上所述,葛根芩连汤上调miR-542-3p表达抑制细胞炎症介质,降低氧化应激来保护UC大鼠,消除肠道炎症。