摩罗丹(浓缩丸)对慢性非萎缩性胃炎模型大鼠的影响

于泽玥 郝莉雨 陈红映 李宗源 孙建辉 霍海如 李洪梅

(中国中医科学院中药研究所，北京，100700)

慢性非萎缩性胃炎(Chronic Non-Atrophic Gastritis，CNAG)是临床常见胃部疾病，目前尚无特效疗法[1]。CNAG是由各种因素联合诱发的慢性胃黏膜炎性疾病，其中幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，Hp)超标是其主要诱因之一。CNAG患者胃黏膜层以淋巴细胞和浆细胞浸润为主，其致病机制主要为防御因子和/或攻击因子失衡[2]。如若不尽早介入治疗，后期极有可能会出现胃穿孔、胃溃疡、胃出血等症状，进而发展为萎缩性胃炎，甚至胃癌，危及生命。摩罗丹(浓缩丸)是由百合、茯苓、玄参、乌药、麦冬、泽泻、当归、茵陈、白术、白芍、石斛、九节菖蒲、三七、川芎、地榆、蒲黄、延胡索、鸡内金等18味中药饮片组成的中药制剂，其中百合可以养津护胃，乌药可以促进消化液分泌，鸡内金能提高胃液分泌量、酸度、促进胃排空和防止胆汁反流，三七可止血、减轻胃黏膜炎症，当归具有抑菌作用，白术和茯苓可提高机体免疫功能，茵陈可利胆，川芎、延胡索具有行气止痛的作用[3-4]。多味药合用，具有和胃健脾、理气消胀、通络止痛的功效。临床上常将其用于治疗各种胃部疾病，如慢性胃炎、萎缩性胃炎等。本项研究通过观察摩罗丹对CNAG大鼠胃黏膜损伤的修复情况，和对血清胃动素、胃泌素的含量影响，以及胃液pH值、胃蛋白酶含量来评价摩罗丹对CNAG大鼠胃黏膜的保护及修复作用，阐明其相关药理机制，为摩罗丹在CNAG方面的作用提供药效学研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级SD大鼠，80只，体质量180～220 g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。大鼠饲养在中国中医科学院屏障环境下，温度20～26 ℃，湿度40%～70%，明暗交替12/12 h。实验动物使用许可证号：SYXK(京)2019-0003。本研究所涉及动物实验通过中国中医科学院中药研究所动物福利伦理委员会审批(伦理审批号：2020B025)。

1.1.2 药物 摩罗丹(浓缩丸)(邯郸制药股份有限公司，生产批号：S00518003)；枸橼酸铋钾颗粒(丽珠集团丽珠制药厂，生产批号：2003034)。

1.1.3 试剂与仪器 无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，生产批号：20181210)；氨水(北京化工厂，生产批号：20180808)；甲醛(天津市大茂化学试剂厂，生产批号：20171111);水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，生产批号：20130201)；去氧胆酸钠[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，美国，生产批号：#SLCC4936]；胃泌素(Gastrin)ELISA Kit试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，生产批号：L200724640)；胃动素(Motilin)ELISA Kit试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，生产批号：L200724647)；0.9%氯化钠注射液(石家庄四药有限公司，生产批号：1908263201)；电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：Sartorius BSA323S-CW]；电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号：PL203 METTLER TOLEDO]；pH计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号：FE20]；酶标仪(伯腾仪器有限公司，美国，型号：Bio Tek Epoch)；自动脱水机(徕卡公司，德国，型号：TP1020)；石蜡包埋机(徕卡公司，德国，型号：EG1140H)；生物显微镜(徕卡公司，德国，型号：DM2500)；全自动轮转式切片机(美康公司，德国，型号：HM355S)；自动染色机(徕卡公司，德国，型号：XL5010)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 选取健康SPF级80只SD大鼠，体质量180～220 g，雌雄各半，按体质量随机选取12只大鼠作为正常大鼠，其余大鼠制备CNAG模型[5]。除正常组外，造模大鼠空腹灌胃60%乙醇溶液，每周2次(周二、周五)，每日在非空腹状态下灌胃20 mmol/L的去氧胆酸钠溶液。第1～6周，以0.05%氨水作为大鼠饮用水，自由饮用；第7～12周，以0.1%氨水作为大鼠饮用水，自由饮用；且采用2 d足量喂食，1 d禁食(周一、周四)，连续造模12周；正常对照组动物不限食物，自由饮用纯净水。于第8周时，随机从正常大鼠中取2只大鼠，从造模动物中取8只大鼠，雌雄各半，取胃，进行组织病理学检查，待慢性胃炎模型复制成功后，再按体质量随机分为5组，即模型组、枸橼酸铋钾颗粒组，摩罗丹(浓缩丸)高剂量、中剂量、低剂量组，每组12只，雌雄各半，继续造模12周

1.2.2 给药方法 各组分别灌胃枸橼酸铋钾颗粒(0.72 g/kg，临床等效剂量的2倍)、摩罗丹(浓缩丸)高剂量、中剂量、低剂量(1.00 g/kg、0.50 g/kg、0.25 g/kg，临床等效剂量的0.5、1、2倍)，灌胃正常组与模型组等体积纯净水，1次/d，连续4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 一般生理状况和体质量 观察大鼠一般生理状况(精神、摄食量、毛发、行为)和体质量变化，记录大鼠给药前与给药后每周的体质量。

1.2.3.2 标本采集 末次给药后，各组大鼠禁食16 h，实验当天所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打开腹腔，并结扎幽门下0.3 cm处，缝合腹腔。待5 h后，将大鼠麻醉，腹主动脉取血，静置2 h后，离心半径16.7 cm，3 500 r/min,离心15 min，分离血清，于-80 ℃冰箱保存；剪开结扎处收集胃液，3 000 r/min,离心15 min，取上清液待测。

1.2.3.3 胃黏膜组织病理学检查 取出胃，收集胃液后，沿胃大弯剪开，用冰生理盐水冲洗，并迅速置于10%甲醛中固定24 h。24 h后取出流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片3.5 μm，苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色，中性树胶封片，显微镜下观察、照相。光学显微镜下观察大鼠胃的病理形态学改变，进行组间比较。

1.2.3.4 胃液pH和胃蛋白酶活性测定 取胃液上清液，用pH计测定其pH值。并按试剂盒说明书测定胃蛋白酶活性。

1.2.3.5 血清胃动素、胃泌素测定 取血清，按照酶联免疫吸附试验说明书测定血清中胃动素、胃泌素的含量。

2 结果

2.1 摩罗丹对大鼠一般状况和体质量的影响 实验过程中，正常组大鼠精神状态良好，动作敏捷，摄食正常，被毛无明显脱落。造模期间，与正常组比较，造模大鼠精神萎靡，懒食少动，蜷缩，摄食量减少，体质量呈降低趋势。给药期间，与模型组动物比较，各给药组动物精神状态及活动状态变好，摄食量增加，体质量未见明显差异。见图1～2。

图1 摩罗丹对雄性大鼠体质量影响

图2 摩罗丹对雌性大鼠体质量影响

2.2 摩罗丹对胃组织病理形态学的影响 正常组大鼠胃黏膜未见有充血、水肿，浅层黏膜未见有脱落，黏膜下肌层未见有水肿，血管未见有充血，组织结构正常。模型组可见胃黏膜大面积、阶段性脱落，黏液渗出较多，脱落的黏膜内有淋巴细胞、少量浆细胞渗出，并有嗜酸性细胞出现，黏膜炎症细胞浸润，黏膜下肌层充血、淤血，间质充血水肿，组织明显水肿。与模型组比较，枸橼酸铋钾颗粒组、摩罗丹(浓缩丸)高剂量、中剂量、低剂量组大鼠胃黏膜仅有少量脱落，炎症细胞浸润、间质渗出和水肿、肌层充血和淤血，以及腺细胞嗜酸性变等病变症状均有不同程度的减轻。通过对病理学情况进行半定量统计，经秩和检验，得出正常组、各给药组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1，图3。

表1 摩罗丹对CNAG组织形态学的影响方法

病理学判断标准与分级标准：1)“-”：大鼠胃黏膜未见有水肿、渗出，黏膜未见有脱落，黏膜下肌层未见有水肿，血管内未见有明显充血，结构正常；2)“+”：大鼠胃黏膜未见明显水肿，有轻度充血、渗出，小片状病变，有个别腺细胞轻度水肿，肌层有少量嗜酸性细胞渗出，未见有明显组织水肿；3)“++”：大鼠胃黏膜有小面积水肿、充血，黏膜浅层有节段性脱落，有少部分腺细胞有水肿、嗜酸样变，细胞个体较大，胞质被染成粉色。肌层有少量炎症、充血，组织轻度水肿；4)“+++”：大鼠胃黏膜浅层有脱落，黏膜间质有充血、渗出性黏液及水肿；部分胃腺细胞肿大，胞质粉染，黏膜层有淋巴细胞、浆细胞渗出，黏膜下肌层有大量嗜酸性细胞浸润及少量浆细胞渗出，肌层组织有大面积水肿，血管内淤血、充血较严重；5)“++++”：大鼠胃黏膜有大面积节段性脱落，浅层较重，黏液较多，脱落的黏膜内有少量淋巴细胞、浆细胞渗出，并有少量嗜酸性细胞；胃黏膜间质有水肿，黏膜上层有部分腺细胞肿大；黏膜下肌层有大面积充血、淤血，嗜酸性细胞浸润，组织水肿。

2.3 摩罗丹对胃液pH和胃蛋白酶活性的影响 模型组大鼠较正常组大鼠胃蛋白酶含量有所下降，胃液pH值显著降低(P<0.05)。各给药组较模型组胃液pH值、胃蛋白酶含量有不同程度的升高。其中，摩罗丹(浓缩丸)高剂量组、枸橼酸铋钾颗粒组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4～5。

图3 各组大鼠胃黏膜组织病理学结果(HE染色，×200)

图4 各组胃液pH值

图5 各组胃液胃蛋白酶含量

2.4 摩罗丹对血清胃动素、胃泌素含量的影响 模型组较正常组胃泌素含量上升，胃动素含量下降。各给药组较模型组胃动素含量有不同程度的上升，胃泌素含量有不同程度的下降。其中，摩罗丹中剂量组、低剂量组胃动素表达水平与模型组差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图6～7。

图6 各组胃泌素含量

图7 各组胃动素含量

3 讨论

中医学将CNAG归属于“胃痛”“嘈杂”“胃痞”等病证范畴[6]。中成药干预是我国CNAG治疗的重要组成部分，一项发表于2017年的《慢性非萎缩性胃炎中西医结合诊疗共识意见》中将香砂六君丸、三九胃泰颗粒等11种中成药作为治疗慢性萎缩性胃炎的推荐药物[7]。目前，已有研究证明摩罗丹对萎缩性胃炎、慢性胃炎有显著的治疗效果[8-12]。摩罗丹能够显著降低萎缩性胃炎患者表皮生长因子及其受体的表达，以调节胃黏膜细胞的增殖、分化，调节胃酸分泌，修复胃黏膜；摩罗丹与常规西药合用(如莫法替丁、奥美拉唑等)治疗萎缩性胃炎见效更快；摩罗丹与叶酸、维生素E联用，可以治疗萎缩性胃炎，甚至逆转轻、中度胃上皮内瘤病情的进展。且摩罗丹治疗慢性胃炎的急性毒性和长期毒性实验证明其安全有效，无不良反应[13]。截止到目前，在国家不良反应监测中心未出现任何药物不良反应报告。本实验主要研究摩罗丹对CNAG的治疗作用，为摩罗丹在非萎缩性胃炎方面的药效学研究提供实验依据。

CNAG的主要症状为胃黏膜损伤，在动物实验中，CNAG模型大鼠常采用饥饱失常、低浓度氨水溶液与水杨酸钠溶液或去氧胆酸钠溶液联合制备[14-16]。本实验采用饥饱失常法联合低浓度氨水溶液、去氧胆酸钠溶液，使大鼠胃防御屏障与刺激因素失衡，模拟Hp感染状态下高浓度的氨对胃黏膜的毒性损害，进而引起慢性或急性炎症损伤，来制备CNAG鼠模型，且其表现与临床症状相似。模型组胃黏膜病理检查结果显示胃黏膜大面积脱落，脱落的黏膜内有淋巴细胞、少量浆细胞渗出，并有嗜酸性细胞出现，黏膜下肌层充血、淤血，组织水肿等，与正常组胃组织病理学结果差异有统计学意义(P<0.01)，提示本实验CNAG大鼠模型制备成功。

CNAG大鼠分别经过摩罗丹(浓缩丸)高剂量、中剂量、低剂量治疗后，病理结果显示与模型组大鼠比较，各给药组胃黏膜组织均有不同程度的改善和修复(P<0.01)，提示摩罗丹(浓缩丸)可以保护和修复CNAG的胃黏膜组织，摩罗丹(浓缩丸)高剂量、中剂量、低3个剂量组与2倍临床等效剂量的阳性对照药治疗效果相当。此外，胃酸pH过低会引起空腹胃痛、损伤胃黏膜组织[17]。本实验结果显示摩罗丹(浓缩丸)可以通过恢复CNAG模型大鼠胃液pH值至正常水平来维持、保护胃黏膜组织。但此次给药组相较于模型组胃液中胃蛋白酶的含量差异无统计学意义。

胃动素又名脑-肠肽激素，对胃肠运动与胃肠电活动都有较大影响。胃动素可刺激胃蛋白酶的分泌，使胃黏膜血流量增加，维持胃酸pH值正常水平，对胃组织不同区域的肌细胞有明显的收缩作用[18-19]。故而胃动素释放含量降低时，胃蠕动能力下降，胃酸pH值易失衡。胃泌素主要由胃窦部G细胞合成，其主要生物学功能包括：促进胃黏膜上皮细胞生长、增殖和分化，刺激胃酸分泌，促进胃黏膜修复等，但当其分泌过多时，会损伤胃黏膜组织[20]。本实验中，模型组大鼠血清胃动素含量较正常组下降，枸橼酸铋钾颗粒组、摩罗丹高剂量、中剂量、低剂量组大鼠胃动素含量有不同程度的上升，其中摩罗丹中剂量组和低剂量组较模型组差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，这提示摩罗丹(浓缩丸)治疗CNAG可能与调节胃动素的分泌有关。本次实验中，各给药组血清胃泌素含量与模型组比较，未见明显差异。

综上所述，摩罗丹(浓缩丸)能够减轻CNAG大鼠的胃黏膜损伤，其作用机制可能与维持胃液pH值，调节胃动素的分泌的有关，表明摩罗丹(浓缩丸)对CNAG有较好的治疗作用，并对胃黏膜有修复损伤和保护作用。