基于对照品和对照提取物的中药复方质量控制对比研究

张 颜 周德勇 王 路 高艳艳 林天凤 刘 斌 姜艳艳

(北京中医药大学中药学院，北京，102488)

中药对照提取物是中药的“标准”提取物，是一类非单体成分对照品，一般通过特殊的提取分离工艺制备而成[1]。具有化学成分组成相对明确、指标成分含量确切、适合多成分分析等特点，可用于薄层色谱或其他色谱鉴别，以及高效液相色谱法的含量测定[2]。对照提取物首次在2005年版《中华人民共和国药典》中作为中药标准物质出现，并且随着药典修订工作的不断推进，更多的对照提取物被收载和应用[3]。2020年版《中华人民共和国药典·四部》中就收载了人参茎叶总皂苷、三七总皂苷、广陈皮对照提取物、银杏叶提取物等23种对照提取物[4]。美国药典(US Pharmacopoeia，USP)和欧洲药典(European Pharmacopoeia，EP)对于对照提取物也有相应的收载和应用[5-7]。虽然中药对照提取物在对照物质总数量中的比例并不大，但是中药对照提取物具有一些特点和优势，能够弥补中药化学对照品和对照药材在生产、供应、使用等环节中存在的不足，对中药质量标准的完善和检测效率的提高具有促进作用[8]。

中药复方是中医用药的主要形式，在中医药医疗活动中发挥着不可替代的作用。中药复方的功效发挥是其所含有效成分综合作用的结果，是多成分、多靶点、多途径作用的体现[9]。因此，中药复方的质量控制和评价研究应依据其特点开展。近年来，中药复方质量控制方法研究成为中药现代化的重要研究领域之一[10]。为了保障中药复方制剂的安全性与有效性，中医学者开展了大量的系统研究，旨在建立符合中药复方特点的系统、科学、全面的质量控制方法。

现阶段，中药质量控制基本都是借鉴化学药品的控制模式，采用单一对照品评价中药质量，由于中药成分的多样性及复杂性，这种方法往往具有一定的局限性。而对照提取物可以同时对多个组分进行含量测定，体现了中药整体质量控制的思想。将中药对照提取物应用于中药及中药复方质量控制具有独特的优势：相对固定的化学组成，安全、稳定的理化特性；专属性较强；可以减少化学对照品的使用，降低检验成本；配制操作简单，溶解于有机溶剂后可直接使用，使药品检测更加简便、快捷[11]。因此，开展中药对照提取物研究并探索将其用于中药及中药复方的质量控制具有较大的应用价值，能够解决目前中药质量控制研究中的诸多问题。

决明子为豆科植物钝叶决明CassiaobtusifoliaL.或决明(小决明)CassiatoraL.的干燥成熟种子。具有清热明目、润肠通便的功效。临床常用于目赤涩痛、羞明多泪、头痛眩晕、目暗不明、大便秘结[12]。决明子作为脂康颗粒中的重要药味，由决明子、枸杞子、桑椹、红花、山楂四味中药组成，具有滋阴清肝、活血通络的作用，临床上可用于治疗肝肾阴虚挟瘀所引起的高脂血症等疾病[12]。课题组前期系统开展了决明子萘并吡喃酮类对照提取物制备及定殖研究，并将其应用于决明子药材的质量控制与评价[13-17]。文献及前期研究结果显示，将中药对照提取物用于中药及中药复方的质量控制，稳定性、重复性良好，结果准确度高、可行性强[18-21]。在此基础上，以脂康颗粒为例，分别采用化学对照品法和对照提取物法，建立含有决明子的中药制剂脂康颗粒的含量测定方法，并对测定结果进行对比分析。进一步探讨决明子萘并吡喃酮类对照提取物用于中药复方质量控制中的可行性和适用性，为全面评价决明子药材及复方质量提供研究基础，为中药对照提取物在中药复方质量控制与评价工作中的适用性和可行性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 分析样品 枸杞子、桑葚、山楂、红花4种药材和各批次脂康颗粒(批号：170310)样品均由同仁堂(望京店)提供。

1.1.2 试剂 决明子苷B2对照品、决明子苷C2对照品、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷对照品、决明子苷C对照品由北京中医药大学中药学院自制，经过结构鉴定及色谱检测计算，纯度均大于98%；乙腈、甲醇为色谱纯(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，美国，批号：155805)；纯净水；甲醇为分析纯(天津市致远化学试剂有限公司，批号：2020121025)；乙醇为分析纯(天津市大茂化学试剂厂，批号：20190806)；乙酸为分析纯(汕头市西陇化工厂有限公司，批号：080312)。

1.1.3 仪器 循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司，型号：SHB-Ⅲ)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE)；高效液相色谱仪(沃特世科技(上海)有限公司，美国，型号：1525型)；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(安捷伦科技(中国)有限公司，美国，型号：ZORBAX SB-C18)；十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司，型号：Sartorious BT 25S)。

1.2 方法

1.2.1 对照品用于脂康颗粒含量测定

1.2.1.1 高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇乙腈(5∶4)混合溶液(A)-1%乙酸水(B)等度洗脱(0～30 min，19%A)；流速：1 mL/min；检测波长：278 nm；柱温：35 ℃。

1.2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取决明子苷B2对照品2.75 mg、决明子苷C2对照品2.35 mg、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷对照品4.73 mg、决明子苷C对照品7.96 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液A。精密吸取3 mL混合对照品溶液A，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液B；精密吸取3 mL混合对照品溶液B，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液C；重复以上步骤直至制得混合对照品溶液E。

1.2.1.3 供试品溶液的制备 精密称定脂康颗粒1 g，加入50 mL水溶解，上样于内径为2 cm，高度为25 cm的大孔吸附树脂柱，柱体积为80 mL，先用320 mL 20%乙醇洗脱除杂后，再用480 mL 50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干燥，残渣加30%甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，加30%甲醇并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

1.2.1.4 阴性样品溶液的制备 取枸杞子、桑葚、山楂、红花4味药材适量，按照处方3∶3∶3∶1的比例，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，滤过，滤液合并，减压浓缩成相对密度为1.05～1.10(60 ℃)的浸膏，加入麦芽糊精适量，混匀，喷雾干燥；浸膏粉中加入麦芽糊精适量和硬脂酸镁5 g，混匀，干法制粒，即得阴性样品。按供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液。

1.2.1.5 线性关系考察 精密吸取“1.2.1.2”项下制得的混合对照品溶液A～F各10 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。以对照品进样量为横坐标(X)，色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归。

1.2.1.6 仪器精密度试验 分别精密称取同一供试品溶液6份，每次进样10 μL，以色谱峰峰面积，计算相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)。

1.2.1.7 中间精密度试验 分别精密称取同一批脂康颗粒6份，每份1 g，按“1.2.1.3”项下方法由不同的分析人员在不同的时间制备脂康颗粒样品溶液，分别采用Waters 1525-2998-2707和Waters 1525-2489高效液相色谱仪测定峰面积。

1.2.1.8 供试品溶液稳定性试验 取“1.2.1.3”项下供试品溶液，分别于制备后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h进样，测定色谱峰峰面积。

1.2.1.9 重复性试验 分别精密称取同一批脂康颗粒6份，每份1 g，按“1.2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积。

1.2.1.10 回收率试验 分别精密称取同一批脂康颗粒6份，每份0.5 g，加入对照品溶液适量，按“1.2.1.3”项下方法制备加样回收供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。

1.2.2 对照提取物用于脂康颗粒含量测定

1.2.2.1 HPCL分析 色谱条件与对照品色谱条件相同。

1.2.2.2 对照提取物溶液的制备 精密称取已标定含量的决明子萘并吡喃酮类对照提取物12.88 mg，置于25 mL容量瓶中，加30%甲醇超声溶解，静置，定容，摇匀，即得对照提取物溶液A。精密吸取3 mL对照提取物溶液A于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得对照提取物溶液B；精密吸取3 mL对照提取物溶液B于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得对照提取物溶液C；重复以上步骤直至制得对照提取物溶液E。

1.2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定脂康颗粒1 g，加入50 mL水溶解，上样于内径为2 cm，高度为25 cm的大孔吸附树脂，柱体积为80 mL，320 mL 20%乙醇洗脱除杂后，用480 mL 50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干燥，残渣加30%甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，加30%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

1.2.2.4 阴性样品溶液的制备 取枸杞子、桑葚、山楂、红花4味药材适量，按照处方3∶3∶3∶1的比例，加水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，滤过，滤液合并，减压浓缩成相对密度为1.05～1.10(60 ℃)的浸膏，加入麦芽糊精适量，混匀，喷雾干燥；浸膏粉中加入麦芽糊精适量和硬脂酸镁5 g，混匀，干法制粒，即得阴性样品。按“1.2.1.3”项下方法制得阴性样品溶液。

1.2.2.5 线性关系考察 精密吸取“1.2.2.2”项下混合对照提取物溶液A～F各10 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。以对照品进样量为横坐标(X)，色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归。

1.2.2.6 仪器精密度试验 分别精密称取同一供试品溶液6份，每次进样10 μL，以色谱峰峰面积，计算RSD。

1.2.2.7 中间精密度试验 分别精密称取同一批脂康颗粒6份，每份1 g，按“2.2.3”项下方法由不同的分析人员在不同的时间制备脂康颗粒样品溶液，分别采用Waters 1525-2998-2707和Waters 1525-2489高效液相色谱仪测定峰面积。

1.2.2.8 供试品溶液稳定性试验 取“1.2.2.3”项下供试品溶液，分别于制备后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h进样，测定4种指标性成分的色谱峰峰面积。

1.2.2.9 重复性试验 分别精密称取同一批脂康颗粒6份，每份1 g，按“1.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积。

1.2.2.10 回收率试验 分别精密称取同一批脂康颗粒6份，每份0.5 g，加入对照提取物溶液适量，按“1.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。

1.2.3 复方脂康颗粒含量测定 精密称取12批脂康颗粒粉末，按“1.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别以4个对照品和已知含量的决明子对照提取物为对照，采用高效液相色谱法，测定4种成分的含量，并对不同方法所得的结果进行t检验。

2 结果

2.1 对照品用于脂康颗粒含量测定结果

2.1.1 HPLC分析 混合对照品、供试品和阴性样品色谱图见图1。

图1 混合对照品、脂康颗粒样品及阴性样品的HPLC色谱图

2.1.2 线性关系 决明子苷B2线性范围为0.004 5～0.550 0 μg；决明子苷C2线性范围为0.003 8～0.470 0 μg；红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷线性范围为0.007 7～0.946 0 μg决明子苷C线性范围为0.012 9～1.592 0 μg。

2.1.3 仪器精密度 RSD值分别为0.58%、0.87%、0.90%、0.79%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 中间精密度 决明子苷B2、决明子苷C2、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷及决明子苷C的含量分别为0.08%(RSD=0.77%)，0.010%(RSD=1.20%)，0.15%(RSD=0.93%)，0.04%(RSD=1.05%)，表明该方法中间精密度良好。

2.1.5 供试品溶液稳定性 RSD值分别为1.01%，0.72%，1.23%和0.57%。表明该溶液在制备后24 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性 RSD值均小于3%，表明重复性良好。

2.1.7 回收率 RSD值均小于3%，表明回收率良好。见表1。

表1 加样回收率考察结果(n=6)

2.2 对照提取物用于脂康颗粒含量测定

2.2.1 HPLC分析 对照提取物、供试品及阴性样品溶液色谱图见图2。

图2 对照提取物、脂康颗粒样品及阴性样品的HPLC色谱图

注：A.对照提取物；B.供试品；C.阴性样品；1.决明子苷B2；2.决明子苷C2；3.红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷4.决明子苷C

2.2.2 线性关系 决明子苷B2线性范围为0.004 5～0.550 0 μg；决明子苷C2线性范围为0.003 8～0.470 0 μg；红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷线性范围为0.007 7～0.946 0 μg决明子苷C线性范围为0.012 9～1.592 0 μg。

2.2.3 仪器精密度 RSD值分别为0.74%、0.91%、0.85%、1.20%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 中间精密度 决明子苷B2、决明子苷C2、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷及决明子苷C的含量分别为0.08%(RSD=0.91%)，0.01%(RSD=1.23%)，0.151%(RSD=0.95%)，0.04%(RSD=1.02%)，表明该方法中间精密度良好。

2.2.5 供试品溶液稳定性 RSD值分别为1.10%，1.43%，0.97%和1.24%。表明该溶液在制备后24 h内稳定性良好。

2.2.6 重复性 RSD值均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 回收率 RSD值均小于3%，表明回收率良好。见表2。

表2 加样回收率考察结果(n=6)

2.3 复方脂康颗粒含量测定 决明子苷B2、决明子苷C2、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷和决明子苷C的P值分别为0.233、0.082、0.192、0.198，P值均大于0.05，说明对照提取物可以作为脂康颗粒质量控制中的对照物质，代替相应的化学对照品进行质量评价。见表3。

表3 12批脂康颗粒含量测定(%，n=3)

3 讨论

中药是在传统中医药理论指导下用于防治疾病的药物，其质量直接影响中医临床用药的安全性和有效性。一方面，随着中药市场的扩大、中药品种及产地多元化，一些传统的质量评价方法已经远远不能满足实际需要；另一方面，随着科学技术的高速发展，中医药在国际上的地位和影响力不断增强，因此为了更好地实现中药现代化和国际化，中药标准物质及质量控制也正向着多指标成分同步分析的方向发展[18]。而中药对照提取物正是顺应了这一发展趋势，在中药整体的质量控制中体现出了巨大的优越性，为实现多成分测定的质量控制新模式做出了贡献。

本研究中首次建立了基于决明子萘并吡喃酮类对照提取物(主成分为决明子苷B2、决明子苷C2、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷及决明子苷C)的中药复方脂康颗粒含量测定方法，采用配对样本t检验法分析比较对照提取物和对照品测定结果的异同，发现二者的结果不存在显著差异，表明对照提取物法与对照品法所得结果一样准确可靠，决明子对照提取物可以作为脂康颗粒质量控制中的对照物质，代替相应的化学对照品实现对中药复方的质量控制和评价。进一步明确了对照提取物在决明子复方质量控制中的适用性和可行性，为中药对照提取物应用于中药复方质量控制提供了参考。