柴胡皂苷d对大鼠肝星状细胞TGFβ-Smad信号通路mRNA表达的影响*

陈懿榕，阙任烨，刘进锴，林柳兵，李勇△

1 上海中医药大学附属市中医医院，上海 200071；2 上海中医药大学附属上海市中西医结合医院；3 第二军医大学附属东方肝胆外科医院

肝纤维化是一种在持续性的肝损伤下，发生组织修复反应的动态过程，是由于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成、降解及沉积不平衡引起的病理变化，包含了复杂的细胞和分子机制［1］。防止肝硬化发生和改善肝脏疾病预后的关键在于阻止和逆转肝纤维化［2］。TGFβ-Smad信号传导通路是肝纤维化主要的信息传导途径［3-4］。柴胡皂苷d（saikosaponins-d，SSd）是中药柴胡的有效药理成分，是一种植物雌激素，可以抑制肝星状细胞的增殖，减少细胞周期的作用。本研究拟从分子水平观察柴胡皂苷对大鼠肝纤维化细胞HSC-T6中TGFβ-Smad表达的影响，以探求其对肝纤维化治疗作用的分子机制，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 细胞株大鼠肝星状细胞系HSC-T6为第二军医大学长征医院消化科惠赠，上海中医药大学附属市中医医院实验室传代保存。

1.2 药物及试剂SSd（中国药品生物制品检定所，批号：110778-201409）；雌二醇（Sigma公司，批号：D0005215）；雌激素受体完全拮抗剂ICI182.780（TOCRIS公司，批号：S119108）；雌激素受体α特异性拮抗剂MPP、雌激素受体β特异性拮抗（R，R）-THC（TOCRIS公司产品，批号：4C/144820、5A/138659）。ECL化学发光试剂盒（biosharp，批号：96030020）；牛血清白蛋白（BSA，美国Amresco公司，批号：21G1956242）；蛋白质分子量预染Marker（Pierce公司，批号：00807539）；山羊抗兔HRP标 记 二 抗（Cell Signaling公 司，批 号：AB2099233）；奶粉（上海光明公司，批号：080104）；Trizol抽 提 试剂盒（Invitrogen公司，批号：1382737）；ReverTra Ace-α-®Reverse Transcription Kit（Toyobo公司，批号：432300）；SYBR®Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo公司，批号：656500）；DMEM高糖培养基（Thermo Scientific公司，批号：2186802）；胎牛血清（FBS，奥地利PAA公司，批号：A15108-1479）。

1.3 实验仪器V-5060型二氧化碳细胞培养箱（德国Heraeus公司）；BH-2型光学显微镜（日本Olympus公司）；22R型低温高速离心机（德国Heraeus公司）；TDL-5000B型低速冷冻离心机（上海世义精密仪器有限公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；SSC-24恒温摇床，SSC-24恒温摇床，AF10制冰机（美国SCOTSMAN公司）；垂直电泳仪（Bio-Rad Power/PAC 3000，美国Bio-Rad公司）；Quick-Reference imaging guide FluorChem®多功能显像仪（美国Alpha Innotech公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养实验选用对数生长期细胞，37℃、体积分数为5% CO2、完全饱和湿度条件下，使用DMEM完全培养基（含10%热灭活胎牛血清），常规培养HSC-T6细胞。每48 h更换培养基，细胞生长铺满培养瓶底约80%后，以0.25%胰蛋白酶加0.02% EDTA消化传代。

1.4.2 细胞干预1）常规消化对数生长期的大鼠肝星状细胞HSC-T6，制备单细胞悬液，按每孔1×104/100µL接种于培养板中，24 h贴壁后干预。2）分为空白组（DMSO在37℃处理24 h），雌激素受体完全拮抗剂（FulvestrantICI182.780，ICI）组（用1µM ICI-182780在37℃处理24 h），雌激素受体α特异性拮抗剂｛（1，3-Bis-（4-hydroxyphenyl）-4-methyl-5-［4-（2-piperidinylethoxyphenol）-1H-pyrazole dihydrochloride，MPP］组（用1µM MPP在37℃处理24 h），雌激素受体β特异性拮抗［（R，R）-5，11-Diethyl-5，6，11，12-tetrahydro-2，8-chrysenediol THC］组（用1µM THC在37℃下处理24 h）。每组分为如下4个亚组：对照组（DMSO在37℃处理24 h，然后DMSO在37℃处理4 h）、模型组（DMSO在37℃处理24 h，然后在H2O2在37℃处理4 h）、SSd组（用5µM SSd在37℃处理24 h时，然后在37℃用H2O2处理4 h）、E2组（用1µM E2在37℃处理24 h，然后H2O2在37℃处理4 h）。每孔加入药物，每个浓度设6个复孔。

1.5 观察指标RT-PCR半定量检测HSC-T6细胞TGFβ1、Smad3/7 mRNA的表达：Trizol法抽提细胞总RNA，进行RT-PCR扩增。扩增条件：94℃5 min，72℃延伸5 min。取RT-PCR产物4µL，加上样缓冲液1µL，在1.5%琼脂糖凝胶（含EB）上电泳，80 V，45 min，用UVP凝胶图像成像系统，拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）分析结果。求出每条条带的密度值，以GAPDH PCR产物作为内参照。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.6 统计学方法数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，多组间比较采用ANOVA行单因素方差分析，并行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞总RNA的抽提鉴定紫外分光光度法分析HSC-T6细胞总RNA（Trizol法抽提所得）纯度及浓度；琼脂糖凝胶电泳确定RNA的完整性。结果表明，样品A260/A280的值均介于1.6～2.0之间；RNA完整性保持良好。见图1。

图1 琼脂糖凝胶确定RNA完整性电泳图

2.2 实时荧光定量RT-PCR扩增曲线和溶解曲线结果显示，扩增曲线基线平整，起跳良好，溶解曲线形成单峰，说明引物特异性良好。见图2。

图2 实时荧光定量RT-PCR扩增曲线和溶解曲线图

2.3 SSdHSC-T6细胞TGFβ1、smad3/7 mRNA水平的调节作用与空白组比较，模型组中TGFβ1、smad3、smad7 mRNA的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组TGFβ1表达升高（P＜0.05），SSd和E2能够降低TGFβ1表达，此种作用可被ICI-182780和THC抑制，两组TGFβ1mRNA表达与空白组对应亚组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。MPP对药物的抑制作用不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。Smad3在模型组中高表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。Smad3表达在SSd和E2处理后明显降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），此种作用可被ICI-182780和THC抑制，两组Smad3 mRNA表达与空白组对应亚组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。MPP对药物的抑制作用不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组比较，Smad7在模型组中均降低（P＜0.05）。SSd和E2能够升高Smad7表达，同时ICI-182780和THC可抑制此种作用，两组Smad7 mRNA表达与空白组对应亚组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。MPP对药物的抑制作用不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3—5。

图3 氧化应激的HSC-T6细胞中TGFβ1表达

图4 氧化应激的HSC-T6细胞中Smad3表达

图5 氧化应激的HSC-T6细胞中Smad7表达

3 讨论

肝纤维化发病是个非常复杂的动态过程，受外界刺激引起的细胞因子释放，细胞与细胞外基质相互作用等多种因素影响，导致大量纤维组织沉积于肝脏，最终形成肝纤维化［5-9］。抑制TGFβ1的表达这个靶点，在抗肝纤维化中有重要作用。正常情况下，TGFβ1表达极少，但肝损伤时其表达明显增加。TGFβ1受体分为TGFβ1Ⅰ型受体（TβRⅠ）和TGFβ1Ⅱ型受体（TβRⅡ），均为跨膜糖蛋白，属丝氨酸/苏氨酸激酶型受体。TβR I与TβRⅡ自身激活体结合形成异源四聚体，磷酸化后活化，作用于胞浆Smads蛋白，启动信号转导。Smads蛋白由氨基端和羧基端的保守序列MH1（Mad—Homology domain1）、MH2及富含脯氨酸的连接区组成［10-11］。静息Smad蛋白中，MH1与MH2相互抑制。MH1可与DNA结合，MH2与细胞核内的一些转录因子结合并调节TGFβ1，目标基因的表达，Smads的连接区含有其他调节因子结合的结构域。Smads蛋白按其结构和功能分为3种亚型：1）受体调节 型Smads（R-Smads），包括对应于TGFβ1和Activin的Smad2、3，和对应于BMP的Sma dl、5、8；2）共同通路型Smad蛋白（Co-Smad），即Smad4；3）抑制型Smads（Ⅰ-Smads），包括分别对应于TGFβ1、Activin的Smad7和 对 应 于BMP的Smad6［12］。Smads蛋白家族，是现阶段被确认为细胞内唯一的TGFβ1，R1激酶底物，是TGFβ1由膜受体到内目标基因信号转导途径的中心环节。

前期研究发现，SSd具有类雌激素样作用，是一种雌激素受体调节剂［13-14］。这个现象提示我们将SSd的抗炎保肝作用与雌激素受体通路联系起来。不可否认肝硬化临床发病与性别有关，发病率男女性别之比约为2.6～3.6∶1，且绝大多数女性肝硬化患者为绝经后妇女［15-16］，性别作为独立的危险因子，可加快慢性肝病向肝硬化转变的进程，显示性激素对肝纤维化的发展起着重要的抑制作用。雌激素抗肝纤维化的相关研究资料证实，肝细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞和星状细胞均存在雌激素受体；雌激素能够改善受损肝脏的微循环，抑制活化的HSC的增殖和胶原的合成，促进肝细胞中抗氧化酶-GPx的活性，抗脂质过氧化，调节转化生长因子等细胞因子表达等，抑制肝纤维化发生发展［17-22］。由此我们推测，SSd保肝抗炎、抗肝纤维化作用是通过雌激素受体途径实现的。

本实验结果显示，经H2O2刺激后，HSC-T6细胞促纤维化指标明显增加，E2、SSd作用细胞24 h后，细胞内TGFβ1、Smad3表达低于模型组，Smad7表达增多，起到抗纤维化进程的作用。此种作用可被ER完全拮抗剂和ERβ拮抗剂拮抗，提示SSd对纤维化细胞因子的影响可能是通过ER途径发挥作用，并且主要通过ERβ亚型进行干预，此结果也验证了我们的推测。

综上所述，TGFβ-Smad通路在肝纤维化的形成及进展过程中发挥很大作用，可以促进HSC的增殖和活化，促进其分泌大量胶原，并减少胶原的降解导致大量胶原异常沉积，表现出促进肝纤维化的作用。而SSd通过雌激素受体途径实现保肝抗炎、抗肝纤维化作用。