阿胶益寿口服液中陈皮的质量控制方法研究*

朱喜春，徐继军△，朱旭江，陈乾兑，姚世霞，张明童，李成明，李子彬

1 甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070；2 国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室；3 长春中医药大学；4 甘肃省中医院

阿胶益寿口服液是常用的中药成方制剂，具有补气养血的功效，临床主要用于治疗气血双亏、未老先衰、四肢无力、腰膝酸软、面黄肌瘦、健忘失眠、妇女产后诸虚等症［1］。阿胶益寿口服液由人参、炙黄芪、制何首乌、熟地黄、阿胶、陈皮、木香、甘草等组成，收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第六册》（标准编号：WS3-B-1143-92），该标准中鉴别项只有化学鉴别一项，不能有效地控制制剂质量。陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮，存放时间越久，果皮中的辛辣气味越弱，药用效果就越好［2］。由于陈皮具有理气健脾，燥湿化痰的作用，在该方中为佐使药，有理气的作用，可增强脾胃的运化功能，加强人体对君药和臣药熟地黄、制首乌的吸收，使其补气养血功能增强，所以方中陈皮有着很重要的作用。陈皮药材的来源五花八门，福橘、大红袍、温州蜜柑等多种柑橘植物均可入药［3-4］。近年来陈皮药材的价格不断攀升，为了降低生产成本，陈皮药材在成药中出现少用、滥用情况，同时由于品种来源等因素导致陈皮药材质量不稳定［5］，寻找一种简单有效的鉴别方法显得尤为重要。为了有效地控制制剂质量，我们采用薄层色谱法和含量测定法对阿胶益寿口服液中陈皮进行了定性定量研究，建立了陈皮简便、准确、重复性好、专属性强的薄层色谱鉴别方法和质量控制方法，用该方法可以控制阿胶益寿口服液的质量，结果满意，未见文献报道此方法，现报道如下：

1 仪器与试药

1.1 实验仪器瑞士CAMAG薄层成像仪，AUTOMATIC TLC SAMPLER自动点样仪（瑞士CAMAG公司）；ME204电子天平（万分之一）（梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；GG-6数显恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；METTLER TOLEDO ME204型分析天平（十万分之一，梅特勒-托利多公司）；昆山KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山舒美仪器有限公司）；LC-20A岛津高效液相色谱仪（日本岛津仪器有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（日本岛津仪器有限公司）；HH-6国华数显恒温水浴锅（日本岛津仪器有限公司）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂，规格：200 mm×100 mm，厚度0.20 mm～0.25 mm）；硅胶G薄层板（Merck公司，规格：10 cm×20 cm）。

1.2 试药及试剂人参、炙黄芪、制何首乌、阿胶、熟地黄、陈皮、木香、甘草经甘肃省药品检验研究院中藏药室鉴定为正品，均符合《中华人民共和国药典》2020年版（一部）项下规定。橙皮苷对照品（纯度：96.2%，批号：110721-201818）、陈皮对照药材（批号：120696-201510），均购于中国食品药品检定研究院；所用试剂均为色谱纯；水为超纯水。

1.3 分析样品来源于10个不同企业的12批次样品。见表1。

表1 阿胶益寿口服液样品来源

2 方法与结果

2.1 定性鉴别陈皮薄层色谱（TLC）鉴别取阿胶益寿口服液10 mL，置分液漏斗中，加乙醚振摇提取2次，每次20 mL，弃去乙醚提取液，再用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇2 mL使完全溶解，作为阿胶益寿口服液样品溶液。取陈皮对照药材1 g，加水50 mL，电炉上加热煮沸30 min，滤过，取续滤液，同样品制成方法，制成对照药材溶液。再取橙皮苷对照品，用甲醇制成每毫升含1 mg的对照品溶液，即得。另取缺少陈皮的阿胶益寿口服液其他样品，按处方比例和制备工艺，制备缺少陈皮的阴性样品，照供试品溶液的制备方法，同法制成阴性样品溶液。依照《中华人民共和国药典》2020年版（四部）TLC试验，分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各点样10µL，点于同一硅胶G薄层板上。以乙酸乙酯-甲醇-浓氨溶液-水（8∶3∶0.7∶1）为展开剂，上行展开，展距约8.5 cm，取出硅胶G板，室温晾干，喷三氯化铝试液，晾干，在紫外灯（365 nm）下检视。结果显示，在供试品与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显现相同颜色的特征斑点，且阴性对照无干扰，结果见图1。

图1 阿胶益寿口服液样品薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件及适应性条件研究色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，安捷伦（Agilent）-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5µm），流动相为甲醇-0.2%磷酸（含0.1%的三乙胺）（35∶65）为流动相，等度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长283 nm，柱温为25℃，进样量为10µL。

2.2.2 供试品溶液的制备方法精密量取阿胶益寿口服液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理样品溶液30 min，放冷，加甲醇至量瓶刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备方法精密称取橙皮苷对照品（中国食品药品检定院，批号：110721-201818）23.60 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇至量瓶刻度线，摇匀，即得橙皮苷对照品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液制备方法按阿胶益寿口服液处方中各药味比例及制备工艺，采用“2.2.2”项下方法制成不含陈皮的阴性对照溶液，即得。

2.2.5 专属性试验取橙皮苷对照品溶液、供试品（批号：181203）溶液及阴性样品溶液，以“2.2.2”橙皮苷含量测定项下的色谱条件进行测定，结果阴性样品色谱在与混合对照品出峰位置相应保留时间处无干扰峰出现，表明阴性样品无干扰，方法专属性好，见图2—4。

图2 阴性对照溶液色谱图

图3 橙皮苷对照品溶液色谱图

图4 样品（181203）溶液色谱图

2.2.6 线性关系考察研究按“2.2.2”项下制备方法，精密称取橙皮苷对照品21.17 mg，置50 mL锥形瓶中，加甲醇至锥形瓶刻度，摇匀，作为贮备液（贮备液浓度0.4073 mg/mL）。精密量取上述贮备液4、2、1、0.5、0.25、0.125 mL，置10 mL锥形瓶中，加甲醇至锥形瓶刻度，精密进样10µL，记录橙皮苷的峰面积。以橙皮苷对照品进样的量（µg）为横坐标（X），橙皮苷测定的峰面积A为纵坐标（Y），进行线性回归分析。结果显示橙皮苷的回归方程为y=2028 574.4357x+36 488.8934，r2=0.999 6，表明橙皮苷在0.025 46～1.629 2µg范围内线性良好。见表2、图5。

表2 橙皮苷标准曲线数据

图5 橙皮苷标准曲线图

2.2.7 精密度试验研究精密吸取“2.2.3”项下制备好的橙皮苷对照品（浓度20.34µg/mL）溶液，按2.2.1色谱条件连续进样6次，每次进样10µL，记录6次测定橙皮苷的峰面积，结果连续进样6次测得橙皮苷的峰面积RSD为0.3%，由实验结果可见所用仪器精密度良好。见表3。

表3 橙皮苷精密度结果

2.2.8 稳定性试验研究取阿胶益寿口服液（批号：181203）溶液，按照“2.2.2”项下样品制备方法制样，分别在0、4、8、12、16、24 h进样10µL，记录上述时间点测定橙皮苷的色谱峰面积，计算上述6个时间点测得橙皮苷峰面积的RSD为1.0%，由稳定性实验可见阿胶益寿口服液在24 h内稳定性良好，能够满足试验需求。见表4。

表4 阿胶益寿口服液稳定性试验结果

2.2.9 重复性试验按“2.2.2”项中供试品溶液的制备方法，取阿胶益寿口服液（批号：181203），分别制备6份供试品溶液，进样10µL测定。样品中橙皮苷的RSD为0.72%，试验结果表明含量测定方法的重复性良好。见表5。

表5 重复性试验结果

2.2.1 0加样回收率试验精密量取1 mL浓度为0.4073 mg/mL橙皮苷对照品溶液置25 mL量瓶中，用氮气吹干溶剂，精密加入阿胶益寿口服液（批号：181203），按“2.2.2”项下橙皮苷含量测定项下供试品溶液的制备方法制备加样回收样品溶液。精密进样l0µL，计算橙皮苷平均回收率为100.25%，RSD值为0.80%，试验结果表明，测定方法回收率良好。见表6。

表6 回收率试验结果

2.3 样品测定按“2.2.2”项下的方法制样，对12批样品进行含量测定，测定结果：橙皮苷含量在0.0106～0.2272 mg/mL之间，平均0.1209 mg/mL。见表7。

表7 样品中橙皮苷含量的测定结果

3 讨论

3.1 提取方法和时间橙皮苷含量测定方法中，考察了用超声提取的方法和加热水浴回流提取的两种常见方法，量取（精密）6份样品，每份样品10 mL，置25 mL的量瓶中，加适量甲醇溶液，超声时间为10、20、30、40、50、60 min，或70℃加热回流0.5、1、2 h后分别测定橙皮苷的含量，结果发现，回流和超声效率相近，但用超声的方法处理更加简捷、高效，且较容易操作，所以选用超声提取法为样品制备方法，这与文献报道一致。超声处理10 min提取峰面积最小，超声20 min的峰面积与超声处理30 min的峰面积相比，稍微小一些，超声处理30、40、50、60 min的峰面积和超声处理30 min的峰面积基本一致，在提取效果近似相同的情况下，为使试验过程更精简，更环保、更经济，选用超声30 min为提取时间。

3.2 色谱条件的确定取阿胶益寿口服液和橙皮苷对照品，在190～400 nm波长范围内进行扫描，结果表明，橙皮苷在220、280、283、284、300 nm都有吸收，参考《中华人民共和国药典》2020年版陈皮品种项下橙皮苷的测定方法及相关文献，最后选择283 nm为检测波长。在此检测波长下对照品和样品都能得到较好的图谱。参考《中华人民共和国药典》2020年版陈皮品种及有关文献［2-14］，考察了两种流动相：1）甲醇为流动相A，0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）为流动相B，甲醇：0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）为（35∶65），等度洗脱；2）乙腈为流动相A，0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）为流动相B，乙腈：0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）为（35∶65），等度洗脱。对测定结果进一步分析发现，当采用甲醇∶0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）（35∶65）为流动相进行洗脱时，得到较好的峰形和分离度。

3.3限度规定12批样品中橙皮苷的含量在0.0106～0.227 2 mg/mL之间，均值0.109 2 mg/mL，均值的80%为0.096 72 mg/mL。《中华人民共和国药典》2020年版（一部）陈皮项下橙皮苷的含量规定为3.5%，本品处方中共有陈皮254 g，入制剂调整为10 000 mL，按药材含量折算，每1 mL的含量为0.889 mg，该值远远高于12批样品中的含量的限度值，这与本品中橙皮苷的提取方式和本品的生产工艺有关，所以不能参考《中华人民共和国药典》2020年版（一部）陈皮项下的含量限度制定本品每1 mL橙皮苷的限度值。应以12批样品含量平均值的80%作为橙皮苷含量的限度值，含量低于该值的企业有4家，其中2家企业含量远低于测量平均值，严重影响限度的制定，为了更科学地制定橙皮苷的含量限度值，不考虑这2家企业对12批样品含量合格率的影响，所以以此值作为本品中橙皮苷的含量限度值，拟定本品中含陈皮以橙皮苷计，每1 mL不低于90µg。

阿胶益寿口服液现行标准中仅有一个化学鉴别项和常规检查项，不能有效控制制剂质量，本研究依据《中华人民共和国药典》2020年版（一部）药材项下相关方法并结合文献［6-9］，建立了陈皮的薄层色谱鉴别方法和含量测定方法，该方法用陈皮对照药材和橙皮苷两个对照物质控制处方中陈皮药材，色谱图斑点清晰，分离度好，阴性无干扰，有效地控制了中成药中只加提取物而不用药材的可能，杜绝了中药制剂的不法添加。在定性鉴别中，参考《中华人民共和国药典》2020年版（一部）药材项下含量测定方法及相关文献［10-14］，建立了制剂中橙皮苷的含量测定方法，该方法简便、准确、重现性好，可为阿胶益寿口服液中质量控制提供参考，为安全用药和有力监管制剂质量提供科学依据。

由于传统观念认为陈皮其功效品质“陈久者良”，但历代本草对其陈化年限语焉不详，文献报道也不多，但是陈皮的“陈”是有限度的［15-16］。特别是广陈皮，不同储藏期的广陈皮挥发油成分在物质种类上基本一致，但在含量上大有不同［17-18］，这将是之后研究的重点。所以建议企业在选料投料中，能够理智地选择药材，不要盲目地认为陈皮越久越好，从而选择年份久的陈皮入药。