壮药青风藤总生物碱对类风湿性关节炎模型大鼠血清P-选择素、PECAM-1表达的影响*

曹知勇，张青槐，庞宇舟△

1 广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200；2 湖北民族大学医学部

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床高发的自身免疫性疾病，主要侵犯人体滑膜关节，发病过程复杂，和多种血细胞相关。其中，与血小板关系最为密切。血清P-选择素（Pselectin，CD62P）是一种选择素黏附分子，在血小板静止期，它几乎没有表达。但在血小板被炎性介质刺激而活化之后，它被暴露于膜表面，又能脱落至血液中，在细胞内外都产生高表达。而P-选择素又能促进中性粒细胞和淋巴细胞等白细胞浸润骨膜关节，导致骨膜异常增生［1］。这样不断恶性循环，导致RA病情逐渐加重。血小板内皮细胞黏附因子（platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1）是一种免疫球蛋白超家族黏附分子［2］。RA炎性表达高的时候，PECAM-1表达也会随之升高，引导中性粒细胞和淋巴细胞做趋化运动，加强炎性介质的浸润渗透。青风藤很早便被运用于RA的治疗，并且疗效显著［3-4］。本研究就青风藤生物碱治疗RA进行分子层面的探讨，观察壮药青风藤对RA模型大鼠血清P-选择素、PECAM-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD大鼠40只，8～10周龄，雄性，体质量200±20 g，购自湖南斯莱克景达，实验动物合格证号：SCXK（湘）2016-002。饲养条件：室温由空调控制在23±2℃，相对湿度55%～68%，高压垫料，每周更换两次。标准维持鼠料，自由饮用净化水。适应性喂养7天后开始用于实验。实验经广西中医药大学伦理委员会审批，符合动物实验要求。

1.2 药物及仪器青风藤干燥藤茎，产地广西，购于广西中医药大学第一附属医院，经鉴定为防己科植物青藤藤茎。天然牛Ⅱ型胶原蛋白、完全弗氏佐剂（Chondrex公司，批号200262）；P-选择素ELISA试剂盒、PECAM-1ELISA试剂盒（南宁市鹏碧实验室器材经营部，批号：20171107，20171109）。Direct-Q5uv型超纯水系统［密理博（中国）有限公司］；单道可调移液器、MiniSpir型迷你离心机、5810R型高速台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；BD23型小型精密恒温箱（德国BINDER公司）；AR224CN电子分析天平［奥豪斯仪（上海）有限公司］；XW-80A型漩涡震荡器（海南市其林贝尔仪器制造有限公司）；DW86290型低温保存箱（澳柯玛股份有限公司）；Infinite M200 pro多功能微孔板检测仪（瑞士帝肯贸易有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备将40只SD大鼠称重后，随机分为空白组8只以及造模组32只。将溶于醋酸的牛Ⅱ型胶原蛋白先于4℃低温保存过夜，第二天与完全弗氏佐剂以等体积乳化。乳化成功后，对造模组大鼠背部及尾部多点行皮下注射，诱导形成RA模型，每只大鼠0.15 mL，7天后进行第二次注射，方法与第一次注射方法相同。空白组大鼠则注射等量的0.9%氯化钠溶液［5］。采用关节肿胀评分对造模大鼠进行评分，分值范围为0～16分。造模第21天进行关节评分，评分＞4分即认定为造模成功。

1.3.2 分组及给药成模大鼠随机分为模型组和青藤碱低、中、高剂量组，每组8只。青藤碱各剂量组分别给予青藤碱混悬液灌胃，浓度依次为：5、10、20 mg/（kg·d）；模型组与空白组灌胃等量0.9%氯化钠溶液；灌胃剂量10 mg/（kg·d），每日1次，持续28天。

1.3.3 标本采集造模成功后，即进行第一轮眼眶取血，离心保存血清。第二次取血于实验结束后禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，取出后，静置2 h，以离心半径10 cm，3000 r/min离心10 min，用移液枪吸取血清保存于-80℃冰箱，用于实验检测。

1.4 观察指标采用ELISA法测定各组大鼠血清中P-选择素、PECAM-1水平，操作方法严格按试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件统计。计量资料以±s表示，采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后大鼠血清P-选择素、PECAM-1表达与空白组比较，造模组大鼠关节肿胀明显，血清中P-选择素、PECAM-1水平明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 大鼠造模后P-选择素、PECAM-1表达（±s）pg/mL

表1 大鼠造模后P-选择素、PECAM-1表达（±s）pg/mL

注：#表示与空白组相比，P＜0.05

组别空白组造模组鼠数8 32 P-选择素21.46±2.62 24.35±0.89 PECAM-1 38.57±4.35#39.13±2.71#

2.2 给药后大鼠血清P-选择素、PECAM-1表达与模型组比较，壮药青风藤各剂量组大鼠血清中P-选择素、PECAM-1表达均明显降低（P＜0.05），且壮药青风藤高剂量组明显低于壮药青风藤低剂量组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠P-选择素、PECAM-1水平比较（±s）pg/mL

表2 各组大鼠P-选择素、PECAM-1水平比较（±s）pg/mL

注：*表示与模型组比较，P＜0.05，△表示与青风藤低剂量组比较，P＜0.05

组别空白组模型组青风藤高剂量组青风藤中剂量组青风藤低剂量组鼠数8 8 8 8 8 P-选择素21.47±3.12*37.93±2.17 24.86±2.79*△28.83±1.78*31.68±2.39*PECAM-1 24.34±1.13*38.56±1.81 28.67±2.23*△29.78±1.84*32.15±2.64*

3 讨论

RA是一种病因不甚明确的自身免疫性疾病，在RA发病过程中，多项血常规指标高于正常水平。中性粒细胞、淋巴细胞、血小板体积宽度以及平均血小板体积等都发生异常变化。研究发现，RA发病过程中，血小板过度活化［6］。而P-选择素和血小板内皮细胞黏附因子表达的增多就是血小板异常活化的产物。杨晓燕等［7］发现血浆P-选择素的测定有助于RA的早期诊断以及病情监测。谢则金等［8］实验进一步发现RA病情活动时，会伴随有血小板的活化，而P-选择素的高表达可作为血小板异常活化的标志。PECAM-1是调节白细胞渗出和血管通透性的结构基础，它的表达随着血小板的变化而变化，参与并维持了血管的完整性［9］。在炎症初期，PECAM-1有助于白细胞的识别和结合，当受炎性因子持续刺激后，内皮细胞连接部位的PECAM-1减少。这样一来，血管通透性增强，促进了大量的的血浆蛋白渗出，从而加强体液免疫。TNF-α、IL-1等类风湿炎性因子能改变内皮细胞PECAM-1的分布，从而参与白细胞血管渗出和通透性调节。血清P-选择素和PECAM-1的表达增加都能促进血小板活性增加，而血小板的活性增加又能够导致二者的高表达［10］。

青风藤中，青藤碱是青风藤中含量最为丰富的化合物［11］，具有镇痛，抗炎的功效。临床使用中发现，青藤碱能有效缓解关节炎症并抑制骨破坏，尤其是针对RA过程中的破骨细胞（osteoclast cell，OC）。青藤碱能够抑制OC有关的信号通路，从而抑制破骨细胞对骨质的损伤［12］。吉金雨［13］总结发现青藤碱可通过降低TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17的水平从而抑制OC分化，防止RA骨破坏。青藤碱抗炎效果明显，临床使用广泛，不良反应较少，且并无耐药性［14］。

本实验研究发现，青风藤总生物碱能有效消除关节肿胀，缓解RA的炎性症状。而青风藤总生物碱组组间比较发现，高剂量组的效果最好，最能降低血清P-选择素和PECAM-1的水平。可见，使用青风藤总生物碱治疗RA，也需要达到一定剂量才能起到治疗作用。本实验证实了青风藤碱能有效治疗RA，可能是通过降低RA模型大鼠血清中P-选择素和PECAM-1的表达来实现的。