脊髓康对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成及硫酸软骨素蛋白多糖表达的影响*

张素，邵阳，华臻，杨俊锋，王建伟，△

1 南京中医药大学，江苏 南京 210023；2 南京中医药大学无锡附属医院

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）多由外伤引起，常导致受损平面以下的运动、感觉、反射及括约肌功能障碍，是造成截瘫的主要原因，近年来，随着现代社会交通、工业的不断发展，其发病率正呈现逐年增高趋势，但目前却仍然缺乏较为理想的治疗药物［1］。因此，寻找疗效显著、安全可靠的治疗SCI的方法是当今基础和临床研究的热点之一。脊髓康是王建伟教授以“肾督同治”理论为指导、结合多年临床实践创制的经验方，具有“祛瘀通督，温肾利湿，调和气血”之功效。前期研究［2-3］证实，脊髓康能明显改善脊髓受损区域微环境、促进轴突再生及神经细胞修复，但脊髓康能否对SCI后胶质瘢痕形成产生影响尚不清楚。硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG）是胶质瘢痕中存在的重要抑制分子，其高表达可制约受损区域神经组织修复再生。为此，本研究拟通过观察脊髓康对SCI模型大鼠脊髓组织受损区域胶质瘢痕形成及CSPG表达的影响，进一步探讨脊髓康治疗SCI的潜在机制，为临床治疗SCI提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择60只SD大鼠，SPF级，体质量（200±20）g，由无锡市血吸虫病防治研究所提供，实验动物合格证号：SYXK（苏）2017-0050。饲养条件：按5只/笼饲养于无锡市血吸虫病防治研究所动物房，自由进食、进水，恒温恒湿。本实验已获南京中医药大学实验动物伦理委员会批准，大鼠在本实验室经1周适应性饲养后方可开始实验。

1.2 实验药物脊髓康药液（药物组成：生黄芪30 g，当归12 g，川芎10 g，丹参20 g，地鳖虫10 g，赤芍12 g，淫羊藿10 g，制大黄10 g等）为王建伟教授临床经验方（国家发明专利ZL200910026193.7），其中生药由南京中医药大学附属医院提供，制成质量浓度为1.25 g/mL的水煎剂，4℃保存。0.3%强的松药液：取300 mg强的松片（意大利辉瑞公司，国药准字H20110064，规格：100 mg/片）研磨成粉，充分溶解于100 mL生理盐水中，4℃保存。

1.3 试剂及仪器PBS（北京solarbio公司，批号：20170517）；多聚甲醛（天津市光复精细化工研究所，批号：20180204）；硫酸软骨素蛋白多糖4（NG2）一抗（英国Abcam公司，批号：BK-K3443）。自制改良Allen’s脊髓损伤造模装置（南京中医药大学骨伤研究所）；4853型冰冻包埋剂OCT（美国SAKURA公司）；CM3050S型冰冻切片机/切片刀（德国leica公司）；BX46型光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；DM500型生物显微镜（德国Leica公司）；7500型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备以7%水合氯醛腹腔注射麻醉（剂量为0.3～0.4 mL/100 g），将大鼠俯卧位固定于手术台上，以T10棘突为中心取背部后正中纵行切口，长约3 cm，逐层进入，沿棘突剥离椎旁肌，显露T9～T11棘突及椎板，仔细咬除T9～T11全部椎板至椎弓根部，暴露硬脊膜并保持其完整性。采用改良Allen法25 g/cm（10 g×2.5 cm）垂直打击大鼠T9～T11节段脊髓，大鼠后肢痉挛性抽搐数次后软瘫为造模成功。逐层缝合肌肉、筋膜、皮肤。术后3天每天予以青霉素8万单位腹腔注射以预防感染，每天2次局部按摩辅助膀胱排尿。

1.4.2 分组及处理将60只SD大鼠称重后随机分为4组：正常对照组、模型组、脊髓康组、激素组，每组15只。除正常对照组，其余3组大鼠均进行造模，造模成功后，分别以等体积的生理盐水、12.5 g/（kg·d）的脊髓康溶液及0.06 g/（kg·d）的强的松溶液灌胃给药，共给药14天。

1.4.3 标本制备按照实验分组，每组分别于干预后3、7、14天随机抽取3例样本，脊髓神经功能评定后以体积分数7%水合氯醛生理盐水溶液麻醉，固定，打开胸腔，经左心室进针至升主动脉，剪开右心耳，PBS快速灌注至流出液体清亮，40 g/L多聚甲醛灌注固定。沿原手术切口暴露椎管，咬除上下节段椎板，轻柔取出脊髓组织，以损伤节段为中心，保留约2 cm长脊髓组织，投入4%多聚甲醛液内继续固定24 h，石蜡包埋，在距脊髓直接损伤处5 mm部位连续进行厚约4～5µm的超薄切片，每个样本10张，用于脊髓组织形态学观察及荧光定量PCR实验。

1.5 观察指标

1.5.1 脊髓组织形态学观察每组随机抽取6例切片标本，分别予HE染色及EnVision法染色，生物学显微镜观察脊髓的病理形态学改变。其中HE染色标本以受损区域星形胶质细胞反应性改变为观察重点，关注胶质瘢痕形成情况；EnVision法染色标本以受损区域CSPG蛋白表达情况为观察重点，以胞浆内淡黄色或棕黄色颗粒染色为阳性表达。

1.5.2 PCR法检测大鼠脊髓损伤区CSPG表达的检测每组随机抽取3例切片标本，PCR法检测大鼠脊髓损伤后CSPG表达，由生工生物工程（上海）公司进行引物设计并合成，行PCR扩增（正反向分别进行）：CSPG4，5'-GTCCTCCTGCTCCTGGCTCTC－3'和5'-ACAGTTGTGAGTGGAATGGCTTGG－3'，再按照qRT-PCR反应体系加样、操作，按两步法进行PCR反应程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，上述变性、退火步骤循环40次，随后继续进行建立熔解曲线的反应：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。反应结束后自动得出扩增曲线和熔解曲线。以管家基因GAPHD作为内参基因，采用2-△△Ct法分析CSPG在脊髓组织中的相对表达量。

1.6 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件包进行分析，定量资料以±s表示，采用单因素方差分析及LSD法两两比较，不满足方差分析条件时采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脊髓组织形态学干预后3天，模型组相对于正常对照组脊髓组织损伤区域内星形胶质细胞反应性肥大和增生明显，胞浆中的CSPG蛋白染色加深，胶质瘢痕逐渐形成，并且保持到14天；激素组与脊髓康组脊髓组织损伤区域内仅有部分星形胶质细胞亦出现反应性肥大和增生，但星形胶质细胞反应性改变及CSPG蛋白染色加深明显弱于模型组，胶质瘢痕形成不明显。见图1—2。

图1 各组大鼠脊髓组织形态学表现（HE，×200）

2.2 大鼠CSPG蛋白表达相对水平模型组脊髓组织损伤区域CSPG表达持续增强，并持续至14天。与模型组比较，脊髓康组大鼠CSPG表达于第3、7、14天呈逐步降低趋势（P＜0.05）；第3天与第14天组内比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。但与激素组相比，脊髓康组大鼠干预后第3、7、14天后的CSPG表达均较高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

图2 各组大鼠脊髓组织形态学表现（EnVision，×200）

表1 各组大鼠脊髓损伤区内CSPG蛋白表达相对水平比较（±s）

表1 各组大鼠脊髓损伤区内CSPG蛋白表达相对水平比较（±s）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与激素组比较，P＜0.05

时间点正常对照组模型组脊髓康组激素组样本量（个）3 3 3 3 3 d 1 8.40±0.85 4.70±0.95*#1.93+0.15*7 d 1 8.60±0.44 3.50±0.30*#1.87±0.31*14 d 1 9.30±0.50 2.90±0.56*#1.73±0.15*

3 讨论

SCI后，脊髓内神经传导通路遭到破坏，损伤部位周围的星形胶质细胞反应性活化增生，同时内源性神经干细胞增殖分化成星形胶质细胞并迁移到损伤处，共同参与胶质瘢痕形成［4］。胶质瘢痕可界定损伤区域和神经组织，阻止异常轴突生长，避免继发性病理损害，具有一定保护作用，但过多形成的胶质瘢痕不仅对神经元再生及轴突延伸形成机械性屏障，还可产生抑制因子，影响神经细胞存活和轴突生长，是阻碍SCI后神经功能恢复的重要原因［5］。

CSPG是目前研究较多的一类抑制因子，来源主要有星形胶质细胞、血源性巨噬细胞、少突胶质前体细胞和脑脊膜细胞，而以后两种细胞尤为重要，其成分为一组共价结合硫酸葡聚糖链的蛋白质，在神经系统内有广泛分布，大多存在于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中。一般认为，CSPG在调节细胞与细胞、细胞与ECM相互作用方面起重要作用，对中枢神经系统的发育和成熟、病损的病理和生理反应具有重要意义。正常情况下，CSPG在正常脊髓组织中仅少量表达，常聚集于神经元树突周围，起到稳定突触、抑制不必要可塑性的作用。SCI后，由于原始的星形胶质细胞反应性活化增生，成为反应型星形胶质细胞，进而形成瘢痕形成型星形胶质细胞，胶质瘢痕大量生成，CSPG表达亦随之逐渐增高。既往研究指出，高表达的CSPG可限制轴突再生、少突胶质细胞迁移和脱髓鞘病变轴突的再髓鞘化［6］。随着研究的深入，近期一些实验又为CSPG可抑制小胶质细胞动员和调控的免疫应答提供新的证据［7］，说明CSPG在继发性脊髓组织病理损害中所发挥的作用还有待更进一步、更全面的认识。

脊髓康是江苏省名中医王建伟教授的经验方。该方由补阳还五汤、小承气汤等经典方化裁而来，方中重用黄芪补脾胃以资气血之源，气旺血行，瘀去络通；当归养血和营，使阴生阳长，血旺气生，有祛瘀不伤血之妙；川芎行气活血止痛；丹参、赤芍、泽泻、制大黄等活血化瘀、理气止痛、通络复髓、利尿通便。诸药合用，共奏祛瘀通督、补益肝肾、调和气血之效。现代药理学研究［8-10］显示，黄芪、芍药、大黄等多种药物单体或提取物被证实可有效干预SCI继发性病变，能够显著减轻脊髓组织病理损害、促进神经功能恢复。而脊髓康作为中药复方，与药物单体或提取物相比，多靶点、多途径、多层次等治疗优势更加明显，在发挥作用时整体性更佳，用于治疗SCI、促进脊髓功能恢复、改善预后的前景十分广阔。

综上所述，减少胶质瘢痕的过度形成及抑制CSPG的高表达是促进脊髓组织损伤的修复和功能重建的重要治疗理念之一。本研究结果表明：SCI后，模型组脊髓组织损伤区域胶质瘢痕大量形成，并伴随CSPG表达持续增强，此过程可持续至第14天。与模型组相比，脊髓康组大鼠脊髓组织损伤区域胶质瘢痕形成受到明显抑制，同时CSPG表达于第3、7、14天皆明显降低，并且CSPG表达呈逐步降低趋势。与激素组相比，脊髓康组胶质瘢痕形成情况差异不明显，而干预后第3、7、14天CSPG表达均明显高于激素组。同时随着干预时间的推移，两组之间的差距似乎呈缩小趋势，说明脊髓康能够显著抑制SCI模型大鼠脊髓损伤区域CSPG蛋白的表达，但其抑制作用与强的松相较还有一定差距。至于脊髓康是否能起到与强的松相近的抑制CSPG蛋白表达的作用，还需要更多的实验样本以及更长时间的治疗周期去验证。

本研究初步证实了中药脊髓康对大鼠脊髓损伤区域胶质瘢痕形成及CSPG表达具有显著抑制作用，这可能是脊髓康参与改善局部微环境、促进轴突再生及神经细胞修复的重要机制之一，对进一步明确SCI的病理演变有着积极意义，同时也为药物研发与临床治疗提供了参考思路。