偏头痛相关外泌体miRNAs表达谱研究现状*

何振曦，高 山，倪夕秀，刘 路，郭 莎，王亚楠，孙铭声，赵 凌（成都中医药大学针灸推拿学院，四川成都 610075）

偏头痛是最常见的原发性头痛之一，其影响了全世界大约15%的人口，男性的患病率大约为6%～8%，女性为15%～25%[1]。与此同时，我国偏头痛的年患病率为9.3%[1]。偏头痛不仅给患者带来严重的身心伤害，而且给患者家庭带来沉重的经济负担。对疾病负担的研究表明，我国偏头痛每年花费约3，317 亿元人民币[3]。偏头痛由于其沉重的经济和社会负担被世界卫生组织列为第六名的有重大疾病负担的疾病[4]。尽管偏头痛的致残程度、直接和间接医疗费用、对日常的生活和工作干扰及社会负担等方面影响严重，但仍有许多患者未得到正确的诊断和及时、恰当的治疗[5]。目前，偏头痛的诊断是基于国际头痛学会（国际头痛疾病分类第三版[ⅠCHD-3]）的头痛分类[6]，主要依靠临床症状进行诊断，包括持续4-72 h 的头痛发作，同时伴有感觉和运动障碍[7]；已有研究发现多种生物标志物成为偏头痛治疗的潜在靶点，如降钙素基因相关肽、5-羟色胺1F、谷氨酸、垂体腺苷酸环化酶、食欲素等，但此类研究只是处于初始阶段，从他们的检测到实际临床应用还需要长时间的验证。与此同时，陆续有研究发现外泌体miRNAs（microRNAs,miRs）有潜力作为偏头痛生物学标志物，其高灵敏度、稳定性、特异性、高效运送性及易得性的特性恰好是外泌体miRNAs 对偏头痛进行精准诊断的优势所在[8-9]。此外，偏头痛与心血管疾病风险也有关联，偏头痛患者患缺血性脑卒中的风险增加了2 倍。虽然心血管事件高风险的大多数结果与先兆偏头痛有关，但最近的研究表明无先兆偏头痛患者（migraine without aura,MWA）的心血管事件风险也会增加[10-12]。在偏头痛和缺血性脑卒中患者中已经报道了能够调节免疫和神经元过程的miRNAs，与这些疾病相关的明确miRNAs 可以作为临床和（或）药物干预的新分子指标[13]。因此，有必要进一步探索这一领域，更多地了解这些生物标志物可以揭示心血管疾病、缺血性脑梗死患者偏头痛的共同病理生理机制。此举对偏头痛相关心血管疾病、缺血性脑梗死的防治具有重要意义。

1 miRNAs概述

miRNAs 是非编码RNA 的一种，为表观调节的一类重要分子，在体内参与细胞増殖、分化、调亡等生理调节，越来越多的证据表明，miRNAs 在疾病的发生发展过程中具有重要作用。miRNAs 被认为通过在3'UTR 位点与mRNAs结合来抑制翻译过程，也有一些文章认为miRNAs 结合到基因的启动子区域可以激活或抑制转录[14]。血液循环中的miRNAs 与蛋白-脂蛋白载体结合，相对稳定，耐髙温、反复冻融，不易降解[15-16]。miRNAs可以以外泌体的方式释放入血，到达远隔组织部位，与受体细胞膜融合，进入靶细胞内，以类激素的形式发挥调节作用，完成细胞间的“通讯联络”[17]。由于外泌体是通过选择性的方式分泌到细胞外空间的，因此外泌体miRNAs 被认为是比血清miRNAs 更为敏感和特异性的生物学标记物。miRNAs 不仅在人类生理学中发挥关键作用，而且在诸如感染性和免疫性非感染性疾病、癌症、代谢和心血管疾病等病理过程中发挥了关键作用[18]。

2 研究现状

2.1 偏头痛潜在的miRNAs生物标记物

虽然关于偏头痛中miRNAs 异常表达的研究很少（见表1），但仍需总结目前的研究结果和不足，为今后的相关研究提供参考。Andersen等人[19]开展了一项研究以评估偏头痛发作期间是否发生血清miRNAs 改变，以及偏头痛是否表现为慢性血清miRNAs 异常。此研究包括24 名偏头痛患者和年龄、性别匹配的健康对照组。偏头痛发作期样本是在疼痛发作后2 小时内采集的，而疼痛缓解期样本则是在至少连续5 天没有偏头痛症状或疼痛后的某1天采集的。在372个被评估的miRNAs 中，32 个miRNAs 被发现有差异表达，进一步的检测发现偏头痛发作与miR-34a-5p 和miR-382-5p 表达的急性上调有关。值得注意的是，miR-382-5p 不仅在发作期间表现出上调，而且在比较疼痛缓解期偏头痛患者和健康对照组时其表达也上调，也被证明是偏头痛的生物标志物（P≤0.01）。因此，作者认为miRNAs可能在偏头痛的病理过程中起重要作用。在另一项研究中[20]，研究人员发现偏头痛阳性家族史亚组血淸miR-188-5p表达量较阴性家族史亚组下降4.2倍，发作期miR-188-5p相对表达量较非发作期下降5.54倍，有明显变化趋势，但未见到显著统计学差异。作者认为血清miR-188-5p水平在偏头痛阳性家族史患者和偏头痛发作期表达有下降趋势，可能与偏头痛阳性家族史和偏头痛发作有关。该研究没有得出阳性结果的原因可能是样本量过小。遗憾的是，在上述两项研究中，没有尝试区分偏头痛类型。潘建青等[21]提取血小板miRNAs 后通过BGⅠSEW-500 sequencing 技术进行测序。总共筛选到821 个差异表达的miRNAs，这些差异表达miRNAs的靶基因主要涉及到：轴突发育等细胞组成；突触前等神经元相关的生物学过程；细胞黏附分子结合等分子功能。作者认为与健康组相比，MWA 患者血小板miRNAs 表达模式发生明显改变，这些miRNAs 主要参与轴突发育以及一些细胞信号传导途径。但遗憾的是该研究结果只是作为一个初步筛查，并没有发现参与轴突发育以及一些细胞信号传导的特异性表达的miRNAs。还有一项最近的研究[22]对MWA 女性患者与健康对照组的循环miRNAs 表达进行了评估。研究发现，与对照组相比，偏头痛患者有4 种miRNAs 的表达差异具有统计学意义：miR-27b 表达上调，而miR-181a、let-7b 和miR-22 表达下调。值得注意的是，在我们的人群中，microRNA 的敏感性和特异性与临床标准的“金标准”具有高度可比性，这表明对这4种miRNAs的综合评估可能成为识别MWA的有效方法。未来还需要对更大的独立人群样本量进行前瞻性研究来验证目前的数据。

表1 偏头痛患者特异表达的miRNAs

表1 （续）

miRNAs 广泛参与脑细胞凋亡、神经炎症、氧化应激、血脑屏障完整性、神经血管生成以及中枢神经系统的其他病理生理过程[23]。有研究[24]发现miR-449a-5p 可通过靶向作用于软件预测出的其在大鼠CALCA 3’-UTR 区的识别序列调节该基因的表达；miR-449a-5p-inhibition 可增加PC-12 细胞内CGRP蛋白的表达量。miR-449a-5p 可通过靶向识别于软件预测出的其在CALCA的3′-UTR 区的结合序列而起到直接调节CALCA 基因表达的作用。据此我们推测，miR-449a-5p 有可能也参与了人类CALCA 基因的表达调控。

2.2 合并缺血性脑卒中、心血管疾病的偏头痛患者miRNAs特征

偏头痛与心血管风险之间的关系是复杂的，可能涉及多种因素，但其中一个可能的病理生理联系在于内皮功能障碍（endothelium dysfunction,ED）。ED 是指内皮细胞功能失调，包括血管张力控制不良及增殖、迁移和形态形成能力异常[25]。ED 与偏头痛密切相关[26-27]，同时也代表了动脉粥样硬化病变发展的第一阶段。miRNAs 参与动脉粥样硬化生物学过程的各个阶段，从ED 到细胞粘附、斑块形成和斑块破裂[28]。偏头痛相关的miRNAs 与动脉粥样硬化事件相关的miRNAs 之间存在功能重叠，进一步说明了血管事件在偏头痛发病机制中的作用[29]。研究[22]表明，与健康对照组相比，偏头痛患者存在miR-27b 显著上调，而miR-181a、let-7b 和miR-22 显著下调等差异。值得注意的是，已知同样的miRNAs 在人类动脉粥样硬化和脑卒中中被调节。let-7a 和let-7b 被证明对氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤具有保护作用[30]，这表明Let-7a和let-7b对动脉粥样硬化等心血管疾病（cardiovascular disease,CⅤD）相关的内皮功能障碍具有保护作用。与此同时，对MWA 的研究显示let-7b 下调，这表明let-7b 下调可能是CⅤD 和偏头痛病理生理学中常见的内皮功能障碍风险增加的特定指标。此外，上述研究中发现的其它在MWA 中发生改变的miRNAs 也被发现与血管功能和CⅤD 事件相关，但其不是特异性地与ED 相关。MiR-27b 在外周动脉疾病患者中过表达，其水平与疾病的严重程度[30]相关。目前研究已经发现miR-181a 和let-7b 在年轻缺血性卒中患者血浆中被调节，这表明它们参与到了脑血管疾病[31]。此外，miR-181a 的降低与代谢综合征患者的心血管疾病独立相关，并且涉及血管生物学、炎症反应和动脉粥样硬化的几个关键基因（NO-synthase 和toll 样受体等）是其假定的靶点[32]。ER-alpha 突变与偏头痛和心血管疾病都相关的事实表明，缺血性脑卒中、心血管疾病和偏头痛之间存在功能联系[33-34]。特异性miRNAs 正在成为偏头痛、缺血性脑卒中和心血管疾病预防的新分子靶点。此外，诱发miRNAs 表达模式和个体间变异可能有助于生物标物记研究，以便直接了解这三种疾病的生物学情况，并识别缺血性脑卒中风险最高的偏头痛人群。于此同时，偏头痛预防、内皮修复、抗炎治疗、血小板抑制或这些策略的结合是否可以预防缺血性脑卒中是未来研究的方向。对这一领域进行进一步的探索是必要的，因为对这些生物标记的进一步了解可以揭示缺血性脑卒中、心血管疾病患者偏头痛的病理生理学机制。

3 miRNAs与偏头痛的治疗

表观遗传学强调通过影响基因修饰、蛋白质与DNA 和其他分子的相互作用来控制基因组中DNA和RNA 序列以外的基因表达的信息。这些变化是可逆的，这使它们成为治疗设计的理想靶点[23]，而miRNAs 正是表观遗传学的重要组成部分。特异性miRNAs 不仅可能成为预防和缓解偏头痛的新的药物分子靶点，而且有希望用于偏头痛疾病诊断、评价治疗效果和监测药物反应。目前尚未发现直接通过外泌体miRNAs 防治偏头痛的研究结果，但通过外泌体给药的方法为我们提供了治疗偏头痛的新思路。实验[35]表明，通过鼻腔给药的外泌体可有效降低偏头痛模型大鼠对皮质扩散抑制的敏感性，但具体机制尚不清楚。Haney 等[36]将过氧化氢酶加载到外泌体中而不显著改变其结构，结果发现该制剂有效地积聚在大脑的神经元和小胶质细胞中，产生了有效的神经保护作用。Zhuang 的研究结果[37]表明，鼻内给药的外泌体通过提高药物的生物稳定性并使其绕过或穿透血脑屏障，成为了非常有潜力的运载工具。

特异性miRNAs 不仅可能成为预防和缓解偏头痛的新的药物分子靶点，也很有希望运用于偏头痛疾病诊断、疗效监测中。Gallelli L 等人[38]发现与健康受试者相比，未经治疗的MWA 患者唾液中检测到hsa-miR-34a-5p 和hsa-miR-375（hsa-miR-34a-5p：P＜0.05；hsa-miR-375：P＜0.01）。此外，与未治疗的MWA 受试者相比，治疗后的MWA 受试者唾液和血液中的hsa-miR-34a-5p 和hsa-miR-375 显着降低。这个结果在另一项平行对照研究中也得到证实[15]，在这项研究中，24例偏头痛患者被纳入两组，分别为治疗组和空白对照组。治疗组中MWA 患者接受药物治疗（镁或非甾体抗炎药）；而空白对照组中MWA的受试者未接受任何治疗。结果发现，与MWA 未接受治疗的受试者相比，MWA接受治疗的受试者唾液和血液中hsa-miR-34a-5p 和hsa-miR-375 显著下降。这些发现表明，hsa-miR-34a-5p 和hsa-miR-375可能是MWA 患者有用的疾病诊断和药物疗效生物学标志物。此外，一项体外研究[39]表明一些特定的miRNAs 也可能是相关的药物反应指标。因此，miRNAs 谱在监测偏头痛患者药物反应方面有潜在应用价值[40]。迄今为止，关于miRNAs 在非甾体抗炎药治疗中的作用的数据还很少发表，值得注意的是，在一个炎症性疼痛动物实验模型中，Qureshi 等人[41]证明塞来昔布能够逆转mmu-miR-211、mmumiR-411 和mmu-miR-342-5p 的下调；塞来昔布还能够上调mmu-miR-1904、mmu-miR-1969、mmu-miR-196a、mmu-miR-337-5p 和mmu-miR-590-5p 的表达。此外，我们很可能运用特异性miRNAs 监测患者对不同治疗方案的疗效，从而为他们定制个体化治疗，实现医疗资源的高效利用。

特异性miRNAs 还有机会在监测药物反应中发挥作用。在偏头痛患者的药物治疗过程中，药物不良反应（adverse drug reactions，ADRs）的发生非常普遍，其发生与剂量误差和药物相互作用有关[42-45]。在这种情况下，miRNAs 监测可用于确定这些患者的给药剂量和给药时间，以降低发生ADRs 或药物无效的可能性。

在中医药领域，由于研究结果的异质性，我们很难系统评价传统中药治疗治疗偏头痛的安全性和有效性，但miRNAs 有机会成为其疗效和副作用的监测指标。针刺作为一种副作用少且有效的非药物治疗方法，在预防偏头痛发作、提高患者生存质量方面表现出了极大的优势。在很多国家，针灸被广泛应用于偏头痛的治疗；国内系统评价针刺治疗无先兆偏头痛临床研究后发现，相对于西药，针刺的不良反应更小[46]。目前研究发现，针刺预处理可以通过调节神经递质及血管活性物质的合成与释放，抑制神经源性炎性反应的发生及三叉神经系统的激活，调节脑血流量，改善脑血管功能及丘脑神经元代谢等机制来起到防治偏头痛的作用[47]。然而，针灸防治偏头痛的机制尚未完全阐明。miRNAs 的表达和水平可能成为评价针刺治疗偏头痛临床疗效的重要基础参数，甚至可能成为解释针刺治疗偏头痛机制的关键环节。

4 结论及展望

尽管在该领域已经有了一些相关研究，但很多结果是相互孤立的。因此，到目前为止，还没有普遍认可的偏头痛血清生物标志物。基于此，我们总结了目前研究存在的问题：一是影响miRNAs 表达的相关混杂因素常常被忽略。这些混杂因素可能包括：①血液采集的具体时间；②患者的年龄和性别；③合并其它疾病，如纤维肌痛[48]，这也增加了重复实验的难度。二是miRNAs 生物学功能的鉴定困难。由于种子区识别序列较短，一个miRNA 可能结合多个靶基因，与此同时，一个基因也可能被多个miRNAs 作为靶标，这种复杂的调节网络，给miRNAs 生物学功能的鉴别带来一定困难。三是在研究设计和志愿者招募过程中，研究者没有区分偏头痛的不同类型。因为不同类型的偏头痛头痛可能具有不同的发病机理，所以它们的miRNAs表达也可能不同。

偏头痛是一种具有重大疾病负担的疾病，由于目前尚不清楚偏头痛的完整病因、发病机制以及缺乏足够有效的对症治疗，因此该领域的研究势在必行。在这个问题上，miRNAs 是近年来的研究热点。虽然外泌体miRNAs 与偏头痛的相关性研究仍然很少，但仍然可以推断：miRNAs 是潜在的偏头痛的发作，发展和预后的生物学标志物，也极有可能成为未来治疗的靶点和疗效监测的重要指标，有希望从根本上改变偏头痛的管理。因此，有必要继续在该领域进行深入研究，确定最有潜力的miRNAs，从而发现其在偏头痛的病因、发病机制、诊断、分类、靶向治疗、对不同治疗方式的反应以及预后的特异性表达以及表达水平的差异。