基于Th1/Th2平衡研究青蒿油对特应性皮炎小鼠模型的干预作用

黄 虎，杨志波，万江波，陶 侃，郭莉莉，秦紫嫣，何彰华，毛必瑶

（1.上海上美化妆品股份有限公司，上海 200065；2.湖南中医药大学第二附属医院皮肤科，湖南 长沙 410005；3.昆药集团股份有限公司，云南 昆明 650106；4.湖南讴睿生物科技有限公司，湖南 长沙 410205）

特应性皮炎（atopic dermatitis）是最常见的慢性炎症性皮肤病，病因复杂多样，以皮肤敏感干燥、局部或播散性湿疹病变，且伴有严重的瘙痒感觉为其发病表型[1-3]。特应性皮炎多数病例开始于婴儿期和儿童期，成年期亦有发生，且越来越多的证据表明特应性皮炎在成人中更为常见[4]。目前研究发现[5，6]，青蒿素及其衍生物具有抗菌消炎、免疫调节的作用，对治疗皮肤病具有良好效果。青蒿油（artemisia naphta oil，AN）作为青蒿素的副产物，也表现出了对痤疮等皮肤病的抑制作用，在皮肤病外治方向具有广阔的应用前景[7]。因此，本研究拟探究AN对卡泊三醇诱导构建的特应性皮炎小鼠的干预作用及具体机制，旨在为延缓特应性皮炎病情进展提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料 96只6周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证编号：430727210103183337，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004]，并通过湖南中医药大学第二附属医院动物伦理委员会批准，严格遵循国家动物饲养规则饲养1周后进行实验。

1.2 方法

1.2.1 试剂 无菌无酶水、4%多聚甲醛、HE染色试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司），吐温20、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），卡泊三醇（上海源叶生物科技有限公司），酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司），AN（上海上美化妆品股份有限公司）。

1.2.2 AN的提取 将青蒿叶与石油醚加热，过滤得到AN溶液，加热溶液，蒸发去除溶液内的石油醚。在100℃～110 ℃下蒸馏，获得AN的粗产物。将AN的粗产物放入精炼罐中110 ℃加热30 min后冷却。在AN中加入硅胶，搅拌30 min后过滤脱色。

1.2.3 分组及模型构建 96只C57BL/6小鼠适应性喂养1周后根据随机数字表法分为Control组、Model组、NC组、0.5% AN组、1.0% AN组、1.5% AN组、3.0% AN组、5.0% AN组，各12只。Control组不做任何处理，其余7组均用20 μl的50 nmol/ml卡泊三醇涂抹小鼠左耳，1次/2 d，持续使用2周，进行特应性皮炎模型构建。此外NC组在造模期间喷涂吐温水溶液1 ml，1次/d；而不同浓度的AN组则每天分别喷涂1 ml 0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%的AN（换算成人体使用浓度依次为0.055%、0.11%、0.16%、0.3%和0.55%）。实验结束后收集小鼠耳部皮肤组织以及血清样本，用于后续检测。

1.3 观察指标 于干预2周后观察小鼠耳部皮肤损伤、组织病理变化、相关炎症因子水平。

1.3.1 小鼠耳部皮肤损伤 观察各组小鼠左耳皮肤损伤变化，并用游标卡尺对各组小鼠的左耳耳尖厚度进行测量，观察AN对特应性皮炎小鼠的耳部皮肤组织的作用。

1.3.2 组织病理变化 采用HE染色观察皮肤组织病理变化，收集各组小鼠的左耳皮肤组织，以4%多聚甲醛溶液固定，经脱水和透明处理，石蜡包埋后切片，再用苏木素-伊红染色，封片后于光学显微镜下观察各组小鼠的皮肤组织病理变化。

1.3.3 相关炎症因子 采用ELISA法检测相关炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE）水平，收集小鼠血清、耳朵匀浆，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪测定波长450 nm处吸光度值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算小鼠相关炎症因子的含量。

1.4 统计学方法 使用Graphpad 8.0统计学软件处理数据，计量资料采用（±s）表示，组间比较行t检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组耳部厚度及皮肤变化比较 Control组耳部皮肤组织完好；与Control组相比，Model组左耳存在肉眼可见的红肿现象，并伴有毛细血管扩张；与Model组和NC组相比，不同浓度AN处理组左耳的红肿及毛细血管扩张现象得到不同程度的改善，且随着AN干预浓度的增加，修复效果也不断提升，见图1。利用游标卡尺测量小鼠左耳耳尖的厚度发现，Model组左耳厚度大于Control组（P＜0.05）；NC组和不同浓度AN处理组左耳厚度小于Model组（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN组左耳厚度均小于NC组（P＜0.05），见表1。

表1 各组左耳厚度比较（，cm）

表1 各组左耳厚度比较（，cm）

注：与Control组比较，*P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05；与NC组比较，&P＜0.05

组别Control组Model组NC组0.5% AN组1.0% AN组1.5% AN组3.0% AN组5.0% AN组n 12 12 12 12 12 12 12 12左耳厚度0.21±0.01 0.46±0.03*0.36±0.04#0.30±0.05#0.31±0.06#&0.28±0.04#&0.28±0.04#&0.26±0.04#&

图1 各组左耳皮肤组织变化情况

2.2 各组左耳皮肤组织HE染色结果比较 Model组左耳表皮层及角质层厚度大于Control组；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN组左耳表皮层及角质层厚度小于Model组和NC组，见图2。

图2 各组左耳皮肤组织HE染色结果（×200）

2.3 各组血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比较 各组间血清TNF-α水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；Model组血清IL-1β、IL-6、IgE水平均高于Control组（P＜0.05）；0.5%及以上浓度AN组血清IL-1β水平均低于Model组（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0%AN组血清IL-6水平均低于Model组（P＜0.05）；各AN组血清IgE水平均低于Model组（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN组血清IL-1β、IL-6、IgE水平均低于NC组（P＜0.05），见表2。

表2 各组血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比较（，pg/ml）

表2 各组血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比较（，pg/ml）

注：与Control组比较，**P＜0.05；与Model组比较，#P＜0.05，##P＜0.05；与NC组比较，&P＜0.05，&&P＜0.05

组别Control组Model组NC组0.5% AN组1.0% AN组1.5% AN组3.0% AN组5.0% AN组n IL-1β 12 12 12 12 12 12 12 12 71.51±18.69 116.94±10.10**111.51±14.98 104.94±12.49#IL-6 57.93±5.77 100.73±9.63**97.73±13.04 93.25±12.22 IgE 6.29±1.74 11.64±1.88**9.54±1.94#8.34±1.11#87.36±8.72##&&84.51±11.50##&7.15±1.48##&74.82±8.23##&&70.00±9.42##&&6.31±1.01##&&96.24±14.91##&76.02±10.17##&7.32±1.41##&&88.98±5.97##&TNF-α 37.92±5.22 39.53±4.69 36.25±6.36 36.46±3.91 35.88±3.91 34.90±6.47 37.68±3.72 35.11±5.86 80.89±9.72##&&6.77±1.37##&&

2.4 三组耳朵匀浆中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比较 Model组耳朵匀浆IL-4、IL-5、TSLP水平均高于Control组，IFN-γ水平低于Control组（P＜0.05）；1.5% AN组耳朵匀浆IL-4、IL-5、TSLP水平均低于Model组，IFN-γ水平均高于Model组（P＜0.05），见表3。

表3 三组耳朵匀浆中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比较（，pg/ml）

表3 三组耳朵匀浆中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比较（，pg/ml）

注：与Control组比较，**P＜0.05；与Model组比较，##P＜0.05

组别Control组Model组1.5% AN组n 12 12 12 IL-4 8.75±2.15 37.72±5.57**13.71±2.38##IL-5 9.51±2.68 40.20±5.05**14.70±2.36##TSLP 9.46±2.53 30.49±6.79**14.72±2.6##IFN-γ 61.79±7.71 15.16±2.43**35.59±2.85##

3 讨论

特应性皮炎是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，发病原因与遗传、免疫和环境之间的复杂相互作用有关，其特征外在表现为皮肤屏障受损，内在表现则为促进炎症反应活化，使患者血清中炎症因子水平显著高于正常人群[8]。临床常用糖皮质激素、免疫抑制剂进行治疗，但是不适合长期使用且存在副作用[9，10]。因此，特应性皮炎亟需寻找有效且安全的治疗方法。近年来，随着对青蒿素认识的逐渐加深，发现其在治疗炎症性皮肤病中具有重要意义。AN作为青蒿素的副产物，也可用于治疗神经性皮炎、皮肤真菌病、痤疮等皮肤疾病，且与临床上常用药剂相比，其耐受性强且不易产生不良反应[11]。

本研究结果显示，Model组左耳呈现红肿现象，且伴有毛细血管扩张，左耳厚度、左耳表皮层及角质层厚度大于Control组；不同浓度AN处理组小鼠左耳的红肿及毛细血管扩张程度、左耳厚度、左耳表皮层及角质层厚度小于Model组，且随着AN干预浓度的增加，修复效果也不断提升。分析认为，特应性皮炎患处皮肤常出现红肿、皮肤增厚等现象，AN可改善特应性皮炎的病理变化，在缓解特应性皮炎进展过程中发挥重要作用。同时，Model组血清IL-1β、IL-6、IgE水平均高于Control组（P＜0.05）；1.0%及以上浓度AN组血清IL-1β、IL-6、IgE水平均低于NC组（P＜0.05）。分析认为，特应性皮炎是炎症性皮肤病，机体中的相关炎症因子水平发生改变，促进炎症的进展；而青蒿素及其衍生物可通过抑制相关促炎因子的产生以改善炎症性皮肤病的严重程度，缓解疾病进展[12]。即1.0%（对应人体使用浓度0.11%）及以上浓度AN能舒缓特应性皮炎小鼠的炎症反应以及相关疾病表型在特应性皮炎的治疗方面具有巨大应用前景。T淋巴细胞的异常活化和浸润介导的免疫功能失调是特应性皮炎疾病进展中的重要因素，其中辅助性T细胞Th1/Th2轴在特应性皮炎发生发展中处于关键地位[13]。特应性皮炎患者机体中调节性T细胞的功能和数量均受到不利影响，机体对Th2细胞的抑制作用减弱，导致Th2细胞的功能亢进，引发一系列的炎性反应，进而促进特应性皮炎进展[14]。本研究结果还显示，Model组耳朵匀浆IL-4、IL-5、TSLP水平均高于Control组，IFN-γ水平低于Control组（P＜0.05）；1.5% AN组耳朵匀浆IL-4、IL-5、TSLP水平均低于Model组，IFN-γ水平均高于Model组（P＜0.05）。分析认为，TSLP是一种新型促敏分子，被誉为炎症反应的“总开关”，可诱导淋巴结内的Th0细胞向Th2型细胞分化，使得Th1/Th2的平衡机制向Th2倾斜，在驱动特应性皮炎疾病进展中发挥重要作用[15]。IL-4、IL-5是由Th2细胞分泌，IFN-γ是由Th1细胞分泌。因此，AN可调节Th2细胞向Th1细胞漂移，改变局部微环境中细胞因子的组成，减轻炎症反应，缓解皮肤损伤，是针对特应性皮炎干预的有效手段。

综上所述，本研究通过动物模型疾病表征、组织病理变化情况以及相关炎症因子的表达情况，明确了AN可通过改善特应性皮炎小鼠机体Th1/Th2平衡，减轻炎症反应，缓解皮肤损伤。