HPLC法同时测定三叶青不同部位中4种成分含量

卞智慧

(无锡市第八人民医院中药房，无锡 214000；*通讯作者,E-mail:zmtg2018@yeah.net)

三叶青，又名三叶崖爬藤、金丝吊葫芦、石猴子等，系葡萄科植物三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的块根[1]，主要分布于江西、浙江、福建、广东等地，是我国特有濒危珍稀药用植物，已被《浙江省中药炮制规范》《湖南省中药材标准》等多部地方标准收录[2-5]，具有活血止痛、清热解毒、祛风化痰之功效，临床上常用于高热惊厥、肝炎、肺炎、风湿、痈疔疮疖、瘰疬、月经不调等症状的治疗[6]。研究表明，三叶青中主要含有黄酮及其苷类、糖类、酚及其苷类、有机酸类、氨基酸和蛋白质类等成分，其中黄酮类化合物的含量最多、活性最强，是三叶青药材的常用药效成分和质控指标成分[7-10]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、提升免疫力、神经保护等广泛活性[11,12]，尤其是抗肿瘤作用，已被广泛地开发应用于各种肿瘤的临床治疗。

目前，中药材在生产加工过程中大部分取某单一部位入药，非药用部位往往被丢弃，既浪费资源，还污染环境。很多中药材的非药用部位有效成分含量是药用部位的数倍之多，甚至药理活性也优于药用部位。因此，加强对中药非药用部位的深入研究及合理开发，既可充分利用资源，还能促进中药产业良性发展。三叶青药用价值极高，全草均可入药，块根可直接食用以补充身体营养和增强免疫，茎和叶可制成茶叶用于感冒等病症的治疗。目前，对三叶青的质量控制研究主要集中在块根部位，对其茎和叶的有效成分含量测定及质量控制研究较少。本实验以绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素4个成分为指标，建立三叶青不同药用部位(根、茎、叶)中4种成分的HPLC含量测定方法，以期为三叶青的临床药用、质量控制、资源开发等提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Agilent Extend C18色谱柱(北京谱合生物科技有限公司)；sartorius BS-124S电子天平(德国赛多利斯公司)；KQ5200B型超声机(昆山超声仪器有限公司)；EPED-10TH超纯水仪(易普易达科技发展有限公司)。

对照品绿原酸(批号111081-201911)，异槲皮苷(批号111809-201806)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(批号112007-201905)、槲皮素(批号100081-201712)均购自中国食品药品检定研究院。三叶青样品及其茎叶购买于江西三叶青农业发展有限公司，经鉴定为葡萄科植物三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的块根和茎叶。甲醇为色谱纯，磷酸等其他试剂均为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相；流速：1.0 ml/min，检测波长：360 nm；进样量：10 μl。梯度洗脱程序为：0～20 min，15%～28%的乙腈；20～45 min，28%～40%的乙腈。

2.1.2 标准品溶液的制备 精密称取各对照品适量，置于50 ml容量瓶中，加80%甲醇溶解，摇匀，定容，得绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素质量浓度分别为145.2，124.5，68.4，186.8 μg/ml的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取干燥粉碎后的三叶青根、茎、叶各1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 ml，称重，超声(功率250 W，频率40 kHz)处理45 min，冷却，再称定质量，用80%甲醇补足减失质量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2 专属性试验

分别取“2.1.2”项下混合对照品溶液、“2.1.3”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样10 μl分析，采集色谱图。对照品与供试品溶液4种成分色谱峰保留时间一致(见图1)，表明方法专属性良好。

1.绿原酸；2.异槲皮苷；3.山奈酚-3-O-芸香糖苷；4.槲皮素图1 对照品与供试品色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance and test substance

2.3 线性关系

精密吸取“2.1.2”项下配制的混合对照品溶液0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 ml置于10 ml的容量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度。按“2.1.1”项下色谱条件进行进样分析，以峰面积Y对进样浓度X计算回归方程，结果见表1。

表1 4种被测成分的线性关系和线性范围

2.4 精密度试验

取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分析，连续进样测定6次。结果显示，绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素峰面积的RSD分别为1.08%，1.43%，1.68%，1.25%(见表2)。表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验

取三叶青根块样品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h按照“2.1.1”项下色谱条件进行进样测定。结果显示绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素峰面积的RSD分别为2.17%，2.07%，1.94%，1.76%(见表3)。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表2 4种被测成分的精密度试验结果 (n=6)

表3 4种被测成分的稳定性试验结果 (n=6)

2.6 重复性试验

取三叶青根块样品，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素峰面积的RSD分别为2.35%，1.94%，0.75%，1.93%(见表4)。表明方法重复性较好。

2.7 加样回收率试验

表4 4种被测成分的重复性试验结果 (n=6)

取已知含量的三叶青根块样品6份，每份约0.5 g，按照1 ∶1的比例加入对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定并计算回收率，结果见表5。结果显示4种成分的平均加样回收率分别为98.8%，101.1%，99.4%，99.2%，RSD分别为1.90%，1.77%，2.05%，1.58%，表明所建立的方法可行。

表5 加样回收率试验结果 (n=6)

2.8 样品含量测定

按“2.1.3”项下方法制备三叶青根茎叶不同部位的供试品溶液，每批均平行制备3份，按“2.1.1”项下色谱条件对其进行含量测定，具体结果见表6。结果显示，三叶青不同部位中4个有效成分的含量存在显著差异，其中三叶青根部位山奈酚-3-O-芸香糖苷含量最高，茎部位4种成分含量均在根和叶之间，叶部位未检测到山奈酚-3-O-芸香糖苷。

表6 不同部位中4种成分的含量测定结果 (n=3,μg/g)

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

分别考察了甲醇、乙腈2种有机相，水、磷酸水、醋酸水3种水相，以及不同比例的酸水。结果发现，以乙腈-0.2%磷酸水为流动相时，能有效降低拖尾现象，各色谱峰之间峰的分离度及峰形均较好，无干扰，因此，选择乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相。

3.2 提取方法的选择

分别对提取溶剂(甲醇、乙醇)、提取方法(超声和回流)、溶剂浓度(60%甲醇、80%甲醇、纯甲醇)、提取时间(15 min，30 min，45 min，60 min)以及料液比(1 ∶10，1 ∶25，1 ∶50)进行了考察，结果显示在80%的甲醇，以1:25的料液比，超声提取45 min下4个被测成分的含量最大。

3.3 检测波长的选择

绿原酸的检测波长为328 nm，异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素3种黄酮类成分的检测波长为360 nm。分别对328 nm和360 nm波长进行分析考察，结果显示在360 nm波长下4个被测化合物的HPLC图谱基线平稳，特征性强，峰型较好。因此选择360 nm作为检测波长。

本实验以绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素4个成分为指标，建立了三叶青不同药用部位(根、茎、叶)中4种成分的HPLC含量测定方法，结果显示，三叶青不同部位中4个有效成分的含量差异显著，其中根中山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量最高，叶中绿原酸和槲皮素的含量最高，根和茎均含有4种成分，叶未检测到山奈酚-3-O-芸香糖苷。所建立的方法准确可靠、简便快捷、重现性高、专属性强，可为三叶青药材的临床药用、质量控制以及资源的合理开发利用提供依据。