双氢青蒿素对大鼠烧伤创面愈合及ERK/JNK信号通路的影响

王 瑞，汤志水，周 林，贾 晶

(西安交通大学第一附属医院整形美容颌面外科，西安 710061)

烧伤是由火焰、热液、强酸等物理化学因素造成的创伤类疾病[1]，其疼痛程度、致残率、致死率较高，容易给患者心理和身体造成极大伤害[2]。皮肤烧伤严重的情况下，经常会出现炎症、水肿、出血、疼痛等症状，往往造成创面愈合缓慢、治疗周期长、治疗费用高等现状，给社会带来严重负担[3]。细胞外调节蛋白激酶(ERK)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的重要组成部分，参与调控炎症介质产生、氧化应激等反应[4,5]。双氢青蒿素是青蒿素的一种衍生物，有较好的抗炎、抑菌、抗肿瘤、调节机体免疫等功效，其水溶性、吸收和治疗皮肤炎性疾病效果较好，且毒性较低、易代谢，是一种治疗潜力较大的化合物[6,7]。本研究通过构建大鼠烧伤模型，观察双氢青蒿素对大鼠烧伤创面愈合的作用，并探究其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SPF级SD大鼠，体质量(230±20)g，购于广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXY(粤)2018-0002。

1.2 主要试剂与仪器

双氢青蒿素(纯度≥98%)购于广州茵格润化工原料厂(B21182-20 mg)；磺胺嘧啶银(SS)乳膏购于昆明华润圣火药业有限公司(国药准字H20057720)；肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒、白细胞介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒、白细胞介素6(IL-6)ELISA试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(PT516、PI303、PI328、S0131M、S0101M、S0051)购于上海碧云天生物技术公司；兔抗ERK1/2(ab184699)、兔抗p-ERK1/2(ab201015)、兔抗JNK(ab199380)、兔抗p-JNK(ab47337)、兔抗GAPDH(ab9485)、山羊抗兔IgG(ab6721)购于Abcam公司。

TGL-16B高速离心机购于上海安亭科学仪器厂；ChemiDoc MP化学发光凝胶成像系统购于美国BIO-RAD公司。

1.3 大鼠烧伤模型构建及给药

参照陈华等[8]的方法，采用金属砝码烧伤法进行大鼠烧伤模型构建。烧伤模型构建成功的大鼠随机分组：模型组、双氢青蒿素低、中、高剂量组、SS组，每组10只。另随机选取10只大鼠作为假手术组(sham组)，将金属砝码置于37 ℃温水中，其余按烧伤模型构建相同方法处理大鼠。将双氢青蒿素溶解在无水乙醇中，按照无水乙醇与橄榄油1 ∶1的比例加入橄榄油，配制成含双氢青蒿素的橄榄油和无水乙醇混悬液，双氢青蒿素低、中、高剂量组给药剂量分别为25,50,100 mg/kg[7]，涂抹在大鼠创面，每天1次；sham组和模型组大鼠创面涂抹等量的橄榄油和无水乙醇混悬液，每天1次；SS组大鼠涂抹SS乳膏2.0 g，每天1次[9]，至大鼠创面愈合。

1.4 大鼠创面愈合情况及愈合率计算

在药物处理3，7，14，21 d时，观察并拍照记录大鼠创面愈合情况。采用Image-Pro Plus图像分析软件测定大鼠创面面积，计算创面愈合率。创面愈合率=(原始创面面积-未愈创面面积)/原始创面面积×100%。

1.5 样品获取

药物处理21 d时，麻醉后摘取眼球取血2 ml/100 g，血液离心(3 000 r/min，10 min)后取上清液，放入-20 ℃保存。之后处死大鼠，切下创面全层皮肤，一部分加入生理盐水，用于制备组织匀浆；一部分放入多聚甲醛中固定，用于创面病理变化检测；一部分放入-80 ℃保存，用来检测ERK1/2、JNK的蛋白表达及其磷酸化水平。

1.6 大鼠创面病理变化检测

将大鼠创面皮肤在多聚甲醛中固定24 h，使用乙醇脱水后，进行石蜡包埋，切成5 μm厚度切片。经HE染色后，通过光学显微镜观察创面组织病理变化情况。

1.7 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测

将大鼠冻存血清快速解冻后，使用ELISA试剂盒分别检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平。操作步骤按试剂盒说明进行。

1.8 大鼠创面组织MDA水平和SOD、CAT活性检测

将大鼠创面皮肤使用生理盐水制备组织匀浆，使用试剂盒分别检测MDA水平和SOD、CAT活性。操作步骤按试剂盒说明进行。

1.9 大鼠创面组织ERK/JNK信号通路相关蛋白(ERK1/2、JNK)表达检测

取1.5中冻存皮肤组织制成组织匀浆，使用RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒提取蛋白并定量。经SDS-PAGE凝胶电泳后，半干转印到PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入ERK1/2兔单克隆抗体(1 ∶1 000)、p-ERK1/2兔单克隆抗体(1 ∶1 000)、JNK兔单克隆抗体(1 ∶1 000)、p-JNK兔多克隆抗体(1 ∶1 000)、GAPDH兔多克隆抗体(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜；加入二抗(1 ∶5 000)，室温下孵育1 h。完成后滴加发光液，使用化学发光凝胶成像系统采集图像，Image Lab软件进行条带灰度值分析。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 双氢青蒿素对大鼠烧伤创面愈合情况及愈合率的影响

参与造模的大鼠出现明显的烧伤创面，说明模型建立成功。大鼠药物处理3 d时，除双氢青蒿素高剂量组创面出现较明显红色外，其余各组间未观察到明显差异(见图1)。药物处理7 d时，模型组大鼠创面出现明显渗出，并伴有结痂现象；双氢青蒿素各剂量组和SS组创面相对干燥，未观察到明显渗出，有结痂，且结痂有脱痂趋势(见图1)。药物处理14 d时，各组创面面积均缩小，尤其是双氢青蒿素高剂量组；模型组创面仍有渗出，且脱痂趋势不明显；双氢青蒿素各剂量组和SS组创面渗液极少，脱痂明显，可观察到创面处有新生背毛，双氢青蒿素各剂量组相较于SS组更加明显(见图1)。药物处理21 d时，模型组创面仍未完全干燥，结痂未完全脱落，创面仍然明显；SS组新生背毛明显，结痂也未完全脱落，创面虽也明显缩小，但依然清晰可见；双氢青蒿素各剂量组结痂基本完全脱落，创面被新生背毛覆盖，皮肤恢复良好，且恢复程度有一定剂量效应关系(见图1)。

药物处理3，7 d时，各组大鼠创面愈合率无明显差异(P>0.05，见表1)。药物处理14，21 d时，双氢青蒿素低、中、高剂量组和SS组创面愈合率明显高于模型组(P<0.05，见表1)。双氢青蒿素对大鼠创面愈合效果具有剂量依赖性，且双氢青蒿素低、中、高剂量组创面愈合率均高于SS组。

2.2 双氢青蒿素对大鼠创面组织病理变化的影响

药物处理21 d时，模型组大鼠创面多数趋于愈合状态，但仍存在炎性细胞浸润、组织结构完整度较差、上皮细胞分化生长不佳等情况。双氢青蒿素各剂量组创面完全愈合，无炎性细胞浸润且上皮细胞生长良好，新生胶原纤维排列整齐，与正常皮肤组织基本接近。SS组创面基本愈合，中间部位上皮细胞完整覆盖，但胶原纤维排列不规则，与正常皮肤组织还存在一定差异性(见图2)。

图1 各组大鼠烧伤创面愈合情况Figure 1 Burn wound healing of rats in each group

表1 各组大鼠烧伤创面愈合率

2.3 双氢青蒿素对大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

与sham组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较，双氢青蒿素低、中、高剂量组和SS组TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05)，且双氢青蒿素各剂量组对TNF-α、IL-1β、IL-6的降低作用呈剂量依赖性。与双氢青蒿素低剂量组比较，SS组TNF-α、IL-1β、IL-6水平无明显差异(P>0.05)；与双氢青蒿素中剂量组比较，SS组TNF-α水平显著升高(P<0.05)，IL-1β、IL-6水平差异不大(P>0.05)；与双氢青蒿素高剂量组比较，SS组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著增高(P<0.05，见表2)。

2.4 双氢青蒿素对大鼠创面组织MDA水平和SOD、CAT活性的影响

与sham组比较，模型组大鼠创面组织中MDA水平明显升高，SOD、CAT活性明显降低(P<0.05)。与模型组比较，双氢青蒿素低、中、高剂量组和SS组MDA水平明显降低，SOD、CAT活性明显升高(P<0.05)，且双氢青蒿素各剂量组间MDA水平和SOD、CAT活性差异具有统计学意义。SS组与双氢青蒿素低剂量组比较，MDA水平和SOD、CAT活性无明显差异(P>0.05)；与双氢青蒿素中、高剂量组比较，SS组MDA水平显著升高，SOD、CAT活性显著降低(P<0.05，见表3)。

图2 各组大鼠创面组织病理变化 (HE，×200)Figure 2 Pathological changes of wound tissue of rats in each group (HE, ×200)

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平

表3 各组大鼠创面组织MDA水平和SOD、CAT活性

2.5 双氢青蒿素对大鼠创面组织ERK/JNK信号通路相关蛋白表达的影响

与sham组比较，模型组大鼠p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK明显升高(P<0.05)。与模型组比较，双氢青蒿素低、中、高剂量组和SS组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK明显降低(P<0.05)，且双氢青蒿素各剂量组间p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK的差异具有统计学意义。SS组与双氢青蒿素低剂量组比较，p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK无明显差异(P>0.05)；与双氢青蒿素中、高剂量组比较，SS组p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK明显升高(P<0.05，见图3，表4)。

1. sham组；2.模型组；3.双氢青蒿素低剂量组；4.双氢青蒿素中剂量组；5.双氢青蒿素高剂量组；6.SS组图3 各组大鼠创面组织p-ERK、ERK1/2、p-JNK、JNK蛋白表达Figure 3 Expression of p-ERK, ERK1/2, p-JNK and JNK proteins in wound tissues of rats in each group

表4 各组大鼠创面组织p-ERK、ERK1/2、p-JNK、JNK蛋白表达

3 讨论

烧伤是一种常见的外伤性损伤，具有很高的发病率和死亡率[2]。为了促进烧伤创面愈合，防止感染和伤口向更深的皮肤层发展，充分的烧伤创面护理是必要的[10]。因此，寻找有效的治疗烧伤的药物是极其重要的。

皮肤在被烧伤后，创面部位会发生炎症反应，组织中出现大量炎性细胞浸润，表面伴有炎性渗出液[11]。炎性渗出液对创面愈合有一定作用，它能够稀释创面组织中的致炎因子和毒素、带走炎症灶内代谢物，并且渗出液中有抗体、溶菌素等物质，帮助减少创面部位病原体或毒素，然而渗出液的主要成分是水，在创面部位长期存在会引起组织水肿，反而会加重损伤，影响愈合[12,13]。有报道称，双氢青蒿素具有较好的抗炎作用[6,7]。但是，目前尚无其在治疗烧伤方面的研究。因此，本研究通过建立大鼠烧伤模型，观察双氢青蒿素对大鼠烧伤创面愈合的影响。结果显示，烧伤大鼠创面在药物处理14，21 d时，双氢青蒿素低、中、高剂量组与模型组比较，大鼠创面部位基本无炎性渗出，脱痂明显，且新生背毛生长趋势良好，组织恢复速度明显加快；另外，创面愈合率也显著提高。这提示，双氢青蒿素能够帮助提高大鼠烧伤创面愈合的速度、缩短愈合时间，并且对创面愈合有促进作用。

皮肤烧伤会导致组织细胞受损，而细胞受损会促进TNF-α、IL-1β、IL-6等大量炎症介质产生[14]，这些炎症介质又能反作用于细胞，激活炎症信号通路，导致更多炎症介质产生，形成恶性循环，减缓创面愈合速度和时间[15]。皮肤烧伤会引起组织水肿，造成组织缺氧，引起细胞正常能量代谢失衡，大量自由基产生，促进氧化应激反应发生。过量自由基会破坏细胞正常组织，如活性氧能够与细胞膜脂质相结合，产生MDA等有毒物质[16,17]。另外，氧化应激反应会抑制如SOD、CAT等抗氧化酶活性，引起氧化抗氧化失衡加重，促进氧化应激病理过程持续进行[18]。炎症与氧化应激反应二者存在相辅相成、相互促进的关系。本研究结果显示，与sham组比较，模型组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，创面组织MDA水平升高，SOD和CAT活性明显降低；而与模型组比较，双氢青蒿素低、中、高剂量组TNF-α等炎症因子及MDA水平明显降低，SOD和CAT活性明显升高，这与双氢青蒿素在小鼠银屑病样皮肤炎症中的抗炎作用一致[19]。这提示，双氢青蒿素能够抑制炎症和氧化应激反应，减轻组织损伤，促进大鼠创面愈合。

MAPK是细胞最重要的信号转导通路之一，在炎症反应、氧化应激、胞质功能调控等方面均有重要作用[20,21]。ERK、JNK是MAPK的重要组成部分，研究显示二者被激活与炎症反应和氧化应激存在密切联系[22,23]。磷酸化ERK1/2和JNK水平的下调有助于烧伤皮肤瘢痕疙瘩的形成[24]。本研究结果显示，与sham组比较，模型组大鼠创面组织中ERK1/2和JNK磷酸化蛋白表达明显升高；而双氢青蒿素低、中、高剂量组与模型组比较，ERK1/2和JNK磷酸化蛋白表达明显降低，这与上述研究一致。说明双氢青蒿素可能通过减少ERK1/2和JNK磷酸化蛋白表达，抑制ERK/JNK通路激活，减少炎症介质产生，减轻炎症和氧化应激反应，从而利于烧伤创面愈合。然而，本研究仅初步探讨了双氢青蒿素能够抑制ERK1/2和JNK的磷酸化水平，但其是否通过抑制ERK/JNK信号通路发挥治疗作用还需进一步研究，后续将通过通路激活剂的干预验证本研究的结果。

综上所述，双氢青蒿素对大鼠创面愈合具有促进作用，其可能的机制是：双氢青蒿素能够通过降低ERK1/2和JNK磷酸化蛋白表达，抑制ERK/JNK信号通路活化，从而减少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症介质产生，同时能够提高SOD和CAT抗氧化酶活性，帮助维持氧化与抗氧化平衡，减轻炎症反应和氧化应激，促进烧伤创面愈合。