ARID1A通过阻断Wnt/β-catenin通路抑制滋养层细胞增殖、迁移和侵袭

谢婷婷，谭明华，吴利英，杨 红

(空军军医大学第一附属医院妇产科，西安 710032；*通讯作者,E-mail:yhong32@163.com)

子痫前期(preeclampsia，PE)是一种妊娠中晚期潜在的多系统性疾病，是导致孕产妇和新生儿发病及死亡的重要病因[1]，但其确切病因及发病机制尚不明确。大量研究[2-6]表明，胎盘在PE的发病机制中处于中心地位，而滋养层细胞作为胎盘的主要成分，滋养层细胞浸润不足所引起的子宫螺旋动脉重塑障碍是导致PE发病的中心环节。研究证实滋养层细胞在胎盘发育中发挥关键性作用，其有限的迁移和侵袭能力可导致滋养细胞侵袭缺陷和螺旋动脉重构异常[7]。因此，研究调控胎盘滋养层细胞迁移和浸润能力的关键因素至关重要。

富含AT的相互作用结构域蛋白1A(AT-rich interactive domain 1A, ARID1A)是染色体重塑复合物SWI/SNF家族BAF亚基中的一个关键成员。已有大量研究[8-10]发现ARID1A在多种肿瘤中存在突变。目前已证实ARID1A作为抑癌基因影响许多肿瘤发生发展的过程，在肿瘤的增殖、侵袭、迁移以及细胞周期等方面发挥重要作用[11]。大量文献表明肿瘤进展与胎盘发育过程有许多共通之处，正常滋养层细胞的迁移、侵袭特性及逃避免疫系统的能力与癌细胞极其相似。目前研究数据显示在人类子宫内膜癌和子宫内膜异位症相关卵巢癌中，ARID1A是一种公认的肿瘤抑制因子[12-14]。另有研究发现ARID1A在PE绒毛膜组织中高表达[15]。但是，ARID1A对滋养细胞迁移侵袭能力等的影响及其在PE发生发展中的作用尚不清楚，本研究通过观察ARID1A对滋养层细胞生物学功能的影响，并阐明其潜在的作用机制，以明确ARID1A在PE发病机制中的作用，为PE提供潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选取2018年11月至2020年9月本院收治的PE患者30例，设为PE组，另选取同期健康妊娠分娩的正常孕妇30例，设为正常组。纳入标准：①符合PE诊断标准；②分娩孕周≥28周；③单胎；④无原发性糖尿病、高血压、冠心病等内外科并发症。PE组排除标准：①排除自发性流产或宫内死胎；②胎儿先天性疾病，染色体异常；③通过辅助生殖技术而怀孕。胎盘组织标本收集前征得所有孕产妇同意并签署知情同意书，组织收集后均-80 ℃冻存。分别采用RT-qPCR法和Western blot法检测胎盘中ARID1A的mRNA和蛋白表达水平。本研究已获得医院伦理委员会批准同意(伦理批准号：No. 2019823)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 人绒毛膜滋养层细胞系HTR-8/SVneo(中国科学院上海细胞库)用含10%胎牛血清(FBS；美国Gibco公司)的RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

为了研究ARID1A对细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，取对数生长期的HTR-8/SVneo细胞，采用Lipofectamine 3000(美国Invitrogen公司)试剂转染ARID1A过表达载体。实验分组为：control组(无处理)、NC组(转染空载体)、ARID1A组(转染ARID1A过表达载体)。采用MTT法检测各组细胞增殖能力，采用Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力，采用RT-qPCR和Western blot法检测各组细胞中ARID1A的mRNA和蛋白表达水平，采用Western blot法检测MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平。

为了研究ARID1A调控细胞增殖、迁移、侵袭的分子机制，采用Wnt/β-catenin通路的激动剂氯化锂(LiCl)处理细胞。实验分组为：control组(无处理)、NC组(转染空载体)、ARID1A组(转染ARID1A过表达载体)、ARID1A+LiCl处理组(转染ARID1A过表达载体后再用50 mmol/L的LiCl处理)。采用Western blot法检测Wnt/β-catenin信号相关蛋白Wnt1、β-catenin和Cyclin D1表达量。

1.2.2 RT-qPCR检测目的mRNA表达量 采用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取组织和细胞总RNA，使用NanoDrop2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行定量。运用PrimeScript RT Reagent试剂盒(日本TaKaRa公司)将总RNA逆转录成cDNA，操作参照说明书。使用SYBR PreMix Ex Taq II试剂(日本TaKaRa公司)在ABI 7500型定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)上进行RT-qPCR检测，运用2-ΔΔCt方法计算ARID1A的mRNA相对含量。

1.2.3 Western blot检测目的蛋白的表达水平 采用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，采用BCA蛋白试剂盒(美国Thermo Fisher公司)测定蛋白浓度。取40 μg蛋白经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，然后电转至PVDF膜(美国Millipore公司)，采用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1 h，加入一抗：anti-ARID1A、anti-MMP-2、anti-MMP-9、anti-Wnt1、anti-β-catenin、anti-Cyclin D1或anti-β-actin(英国Abcam公司)，于4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入HRR标记的二抗，室温孵育1 h。用增强化学发光液ECL(美国Millipore公司)显影，凝胶成像系统曝光拍照，利用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。以β-actin为内参计算蛋白的相对表达水平。

1.2.4 MTT检测细胞增殖 将转染后的各组细胞接种于96孔板中，每孔5×103个细胞，于培养箱中分别培养24，48，72 h后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液(美国Sigma-Aldrich公司)20 μl。孵育4 h后，弃上清，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡5 min至结晶充分溶解。用全自动酶标仪于490 nm处测定OD值。

1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力 侵袭实验：转染后的HTR-8/SVeno细胞用无血清培养基重悬，并调整细胞浓度为3×105个/ml。吸取200 μl细胞悬液加入铺有Matrigel基质胶(美国BD公司)的Transwell小室中，小室下层加入600 μl含10% FBS的RPMI 1640培养基，置于培养箱中培养24 h，用棉签擦去上层未穿透膜的细胞，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色15 min。置于倒置荧光显微镜下，随机选取5个视野观察穿膜细胞并拍照计数。

迁移实验：除了Transwell小室未包被Matrigel基质胶，其余操作同侵袭实验。

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0软件进行数据统计分析，所有实验均重复至少3次。计量资料数据均以均值±标准差表示，先进行正态性检验，若数据服从正态分布，两组间比较采用两独立样本t检验，三组及以上组间比较采用one-way ANOVA方差分析，再采用Bonferroni多重比较。若不服从正态分布，采用两独立样本Mann-WhitneyU检验或多个独立样本的Kruskal-WallisH检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ARID1A在PE患者胎盘组织中高表达

RT-qPCR检测结果显示，与正常胎盘组织相比，PE患者胎盘组织中ARID1A mRNA水平显著升高(t=10.11，P<0.000 1)；Western blot检测结果显示，PE患者胎盘组织中ARID1A的蛋白表达水平显著高于正常胎盘(t=15.53，P<0.000 1，见图1)。

2.2 ARID1A过表达抑制HTR-8/SVeno细胞增殖

采用RT-qPCR和Western blot检测ARID1A过表达载体转染效果，结果发现，与control组相比，ARID1A组的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(F=207.3，P<0.000 1；F=162.8，P<0.000 1，见图2)。与control组相比，ARID1A组细胞24，48，72 h增殖能力显著降低(F=7.51，P=0.015 3；F=23.96，P=0.000 4；F=59.92，P<0.000 1；见图2)。

2.3 ARID1A抑制HTR-8/SVeno细胞侵袭和迁移能力

与control组细胞相比，ARID1A组的细胞侵袭能力和迁移能力显著降低(F=78.23，P<0.000 1；F=34.33，P=0.000 3，见图3)。

2.4 过表达ARID1A抑制侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达

与control组细胞相比，ARID1A组细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平显著降低(F=57.1，P<0.000 1；F=33.52，P=0.000 4，见图4)。

2.5 ARID1A通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制滋养层细胞迁移侵袭

与control组细胞相比，ARID1A组细胞Wnt1、β-catenin和Cyclin D1(的蛋白表达水平显著降低(F=10.86，P=0.001 1；F=35.58，P<0.000 1；F=28.37，P<0.000 1；见图5)；与ARID1A组相比，ARID1A+LiCl组Wnt1、β-catenin和Cyclin D1的蛋白表达水平显著增加(F=10.86，P=0.027 9；F=35.58，P=0.000 1；F=28.37，P=0.000 6)。与ARID1A组相比，ARID1A+LiCl组细胞侵袭(F=78.9，P<0.000 1)和迁移能力(F=36.51，P<0.000 1)显著增加(见图6)。

与control组相比，*P<0.05；与NC组相比，#P<0.05；与ARID1A过表达组相比，&P<0.05图5 ARID1A过表达及LiCl处理对HTR-8/SVeno细胞Wnt、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达水平的影响Figure 5 Effect of ARID1A overexpression or LiCl treatment on the protein expression of Wnt, β-catenin and Cyclin D1

3 讨论

滋养层细胞增殖、迁移和侵袭等功能失调导致螺旋动脉重构受损，对PE的病理发生有重要影响[16]。滋养层细胞浸润不足是引起PE特征性病理变化的主要原因，也是PE发生发展的关键因素。滋养层细胞具有较高的侵袭、迁移等特性，与肿瘤细胞相似，但不同的是滋养层细胞具有严格的时空限制和精细调控，同时仅限于子宫的早期妊娠[4]。因此，深入探究PE的发病机制、干预胎盘滋养层细胞的迁移和浸润能力对寻求新的治疗手段具有重要意义。ARID1A参与肿瘤细胞迁移侵袭过程的调控，且在PE患者胎盘组织中高表达，故推测ARID1A可能通过调控滋养层细胞迁移侵袭过程参与PE病理机制的调控。根据Fantone等[15]的研究结果，PE患者(n=9)胎盘中ARID1A阳性细胞约占90%，健康妊娠分娩的正常孕妇(n=10)胎盘中ARID1A阳性细胞约占3%，采用GPower3.1.9.2软件计算得到各组需要的最小样本量为2。本研究纳入PE患者和同期健康妊娠分娩的正常孕妇各30例，结果发现ARID1A在PE患者胎盘组织中表达水平显著高于康妊娠分娩的正常孕妇。Jin等[17]也发现ARID1A在PE患者胎盘组织中高表达。Fantone等[15]的研究进一步发现ARID1A在正常胎盘的绒毛状和绒毛外细胞滋养层细胞中特异表达，在合胞滋养层细胞无表达；然而，ARID1A在PE患者的胎盘细胞滋养层细胞和合胞滋养层细胞中均有表达；ARID1A是一个滋养层细胞分化不良的分子标志。这提示ARID1A可能在PE发病过程中具有重要作用。

与control组相比，*P<0.05；与NC组相比，#P<0.05；与ARID1A组相比，&P<0.05图6 Wnt/β-catenin通路参与ARID1A对滋养层细胞的侵袭迁移的抑制作用Figure 6 Wnt/β-catenin signaling is involved in the inhibitory effect of ARID1A on cell invasion and migration of HTR-8/SVneo cells

为证实ARID1A在PE发病过程中具体作用，本研究以HTR-8/SVeno细胞为研究对象，结果发现过表达ARID1A显著抑制细胞的增殖、侵袭及迁移能力。Jin等[17]在滋养层样细胞系JEG-3也得出类似的结论。这提示ARID1A可能通过抑制滋养层细胞的侵袭迁移能力参与PE的发生发展。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是参与细胞侵袭转移过程中重要的效应分子，与滋养层细胞的病变密切相关[18]。研究证实，PE患者胎盘组织中MMP-2和MMP-9表达水平显著降低，在PE病理发展中起关键性作用[19,20]。MMP-2表达失调和MMP-2活性降低参与妊娠期高血压患者子宫胎盘异常重构和滋养细胞侵袭[19,21]。MMP-9下调也会导致PE滋养细胞功能障碍，抑制滋养细胞的侵袭迁移过程[22]。本研究结果表明，过表达ARID1A可显著下调HTR-8/SVeno细胞中MMP-2和MMP-9表达水平，证实ARID1A通过调控MMP-2和MMP-9表达从而抑制滋养层细胞的侵袭及迁移能力。

Wnt/β-catenin信号通路通过调节滋养层细胞的侵袭和增殖，在PE发病机制中发挥重要作用[23,24]。有文献报道，重度子痫前期妇女的胎盘中Wnt1、β-catenin和Cyclin D1水平降低，而DKK1水平升高，提示Wnt/β-catenin信号通路的抑制可能导致PE[25]。此外，Wnt/β-catenin信号通路的激活能够促进人滋养层细胞侵袭[26]。然而，在滋养层细胞中，ARID1A是否通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用尚不清楚。本研究结果显示，ARID1A过表达能够抑制Wnt/β-catenin通路相关蛋白Wnt1、β-catenin和Cyclin D1的表达水平，而Wnt/β-catenin的激动剂LiCl能够明显上调这些蛋白的表达，并逆转ARID1A对滋养层细胞侵袭和迁移能力的抑制作用，这提示ARID1A可能调控Wnt/β-catenin信号通路抑制滋养层细胞迁移及侵袭。然而，ARID1A调控Wnt/β-catenin信号通路的机制尚有待进一步研究。

综上，本研究证实ARID1A可能通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制人滋养层细胞HTR-8/SVeno的侵袭迁移过程，为PE的治疗提供新的潜在靶点。