连翘酯苷A通过TLR4/NF-κB p65/NLRP3轴对宫内感染所致新生大鼠肺损伤及免疫功能的影响研究

王 云，赵亚丽，郎明瑶，尹红亚

(1.河北省保定市第二医院儿科 071000；2.河北省保定市第二中心医院儿科 072750；3.河北省儿童医院妇产科，石家庄 050031)

宫内感染主要是由于病原微生物侵入羊膜腔导致胎盘、胎膜发生炎性反应引起，炎性因子的“瀑布式”级联反应常引发新生儿肺功能损伤，与胎儿发生支气管肺发育不良密切相关。连翘酯苷A可抑制感染H9N2禽流感病毒小鼠的炎性反应[1]。此外，连翘酯苷A可增强氧自由基清除力和免疫功能，抑制溃疡性结肠炎大鼠炎性反应[2]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65信号通路激活可促进炎性因子释放。研究发现，芪苈强心胶囊可抑制该信号通路，减轻心力衰竭大鼠心肌组织炎性反应[3]。本研究通过建立宫内感染所致新生大鼠肺损伤模型，连翘酯苷A灌胃治疗，探讨连翘酯苷A对肺损伤和免疫功能的影响，以及对TLR4/NF-κB p65/NOD样受体3(NOD-like receptor 3，NLRP3)信号通路的调节作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

健康清洁级雌性SD大鼠50只，8周龄，体重180～200 g；雄性SD大鼠25只，8周龄，体重190～210 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2018-0001。

1.1.2试剂与仪器

连翘酯苷A(纯度>98%)购自北京国家药品和生物制品控制研究所；脂多糖购自美国Sigma公司；大肠杆菌购自中国兽医药品检察所；白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8和IL-1β ELISA试剂盒购自美国R&D公司；兔抗鼠TLR4、NF-κB p65、p-p65、NLRP3及GAPDH抗体购自美国Abcam公司；CD4+和CD8+单克隆抗体购自北京同立海源生物科技有限公司；酶标仪购自美国Bioteck公司；小动物呼吸功能分析系统(AniRes2005)购自北京贝兰博科技公司。

1.2 方法

1.2.1模型制备[4]

下午4:00后，雌雄大鼠2∶1比例合笼，次日上午用棉签擦拭雌鼠阴道，对其分泌物做涂片检查，显微镜下观察，以精子布满视野记为妊娠第0天。取40只雌鼠在孕第15天，阴道扩张器暴露孕鼠子宫颈，6号注射器将0.2 mL大肠杆菌稀释液注射入子宫颈肌肉内，两侧宫颈均进行注射。造模第2天起，将40只孕鼠分为模型组、连翘酯苷A组、脂多糖组和脂多糖+连翘酯苷A组，每组10只，连翘酯苷A组和脂多糖+连翘酯苷A组孕鼠灌胃连翘酯苷A 50 mg/kg，每天1次，脂多糖组和脂多糖+连翘酯苷A组孕鼠尾静脉注射脂多糖 5 mg/kg，每天1次，直至自然分娩，各组新生大鼠选取10只用于实验。

1.2.2宫内感染判断标准

孕鼠分娩后，留取胎盘组织，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)清洗干净后，进行苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察，若出现血管水肿、充血，中性粒细胞增多则说明发生宫内感染。

1.2.3新生大鼠呼吸频率测定

记录孕鼠分娩情况，7 d后记录新生大鼠存活情况。于出生后第8天将新生大鼠麻醉，切开气管后进行插管，通过导管连接呼吸机和信号调理器，使用肺功能检测软件记录新生大鼠呼吸频率。

1.2.4ELISA检测新生大鼠血清中IL-8、IL-6和IL-1β浓度

呼吸频率记录完成后，断头处死，收集3 mL主动脉血，离心，吸取上清液。严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪上测定波长490 nm处的吸光度(A)值。

1.2.5流式细胞仪检测血清中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+淋巴细胞数量

呼吸频率记录完成后，取3 mL新生大鼠主动脉血于流式管中，严格按照试剂盒说明书操作，流式细胞仪分析CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值。

1.2.6HE染色观察新生大鼠肺组织病理损伤

采血结束后，迅速取出右侧肺组织，进行HE染色，倒置显微镜下观察并拍照，每张切片选取5个视野。

1.2.7Western blot检测肺组织TLR4、p-p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白相对表达水平

左侧肺组织液氮中研磨，裂解，离心，吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度，煮沸。上样、电泳、湿转、洗膜、封闭，TLR4、p-p65、NF-κB p65、NLRP3、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗孵育1 h，洗膜，ECL发光液显色，Image J软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 胎盘组织HE染色

模型组和脂多糖组孕鼠胎盘组织轮廓不清晰，大量炎性细胞浸润；连翘酯苷A组孕鼠胎盘轮廓尚清晰，少量中性粒细胞浸润；脂多糖+连翘酯苷A组孕鼠胎盘组织病理情况较脂多糖组减轻，较连翘酯苷A组加重，见图1。

2.2 孕鼠分娩情况及新生大鼠存活情况

孕鼠分娩情况：模型组、脂多糖组和脂多糖+连翘酯苷A组孕鼠出现早产，均在孕第18～20天分娩，对照组和连翘酯苷A组孕鼠在孕第22～23天分娩，孕鼠无死亡。

新生大鼠存活情况：对照组新生大鼠87只，死亡2只，死亡率2.30%；模型组新生大鼠共85只，死亡8只，死亡率9.41%；连翘酯苷A组新生大鼠82只，死亡3只，死亡率3.65%；脂多糖组新生大鼠82只，死亡8只，死亡率9.75%；脂多糖+连翘酯苷A组新生大鼠80只，死亡5只，死亡率6.25%。

2.3 新生大鼠呼吸频率、肺指数测定

与模型组比较，连翘酯苷A组呼吸频率减慢、肺指数升高，脂多糖组呼吸频率加快、肺指数降低(P<0.05)；与脂多糖+连翘酯苷A组比较，连翘酯苷A组呼吸频率减慢、肺指数升高，而脂多糖组呼吸频率加快、肺指数降低(P<0.05)，见表1。

2.4 ELISA检测结果

与模型组比较，连翘酯苷A组IL-8、IL-6和IL-1β水平降低，脂多糖组升高(P<0.05)；与脂多糖+连翘酯苷A组比较，连翘酯苷A组IL-8、IL-6和IL-1β水平降低，脂多糖组升高(P<0.05)，见表2。

A：对照组；B：模型组；C：连翘酯苷A组；D：脂多糖组；E：脂多糖+连翘酯苷A组。

表1 新生大鼠呼吸频率、肺指数比较

2.5 肺组织HE染色

模型组新生大鼠肺泡体积明显增大，多数肺泡隔增厚，且可见大量炎性细胞浸润；连翘酯苷A组肺泡稍扩张，少量肺泡隔增厚，少量炎性细胞浸润；脂多糖组新生大鼠肺组织病理改变较模型组严重；脂多糖+连翘酯苷A新生大鼠肺组织病理变化较连翘酯苷A组加重，较脂多糖组减轻，见图2。

表2 血清IL-8、IL-6和IL-1β水平比较

A：对照组；B：模型组；C：连翘酯苷A组；D：脂多糖组；E：脂多糖+连翘酯苷A组。

2.6 流式细胞仪检测结果

连翘酯苷A组CD4+/CD8+(1.27±0.10)高于模型组(1.03±0.12)，脂多糖组(0.82±0.17)低于模型组(P<0.05)；脂多糖+连翘酯苷A组CD4+/CD8+(1.15±0.11)低于连翘酯苷A组，高于脂多糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.7 Western blot检测结果

与模型组比较，连翘酯苷A组TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相对表达水平降低，脂多糖组TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相对表达水平升高(P<0.05)；与脂多糖+连翘酯苷A组比较，连翘酯苷A组TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相对表达水平降低，脂多糖组TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相对表达水平升高(P<0.05)，见表3、图3。

表3 肺组织中TLR4、p-p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白相对表达水平比较

A：对照组；B：模型组；C：连翘酯苷A组；D：脂多糖组；E：脂多糖+连翘酯苷A组。

3 讨 论

宫内感染常通过胎盘垂直传播造成胎儿先天性感染，胎龄越小，发生宫内感染的概率越高，是引起早产儿不良结局的重要原因[5]。支气管肺发育不良是早产儿常发生的一种慢性肺部疾病，其主要的病理学改变为肺泡及肺微血管发育不良，而宫内感染引起羊水、胎盘和胎膜中炎性细胞积聚，并分泌大量炎性因子，被认为是支气管肺发育不良的主要因素[6]。

ZHENG等[7]研究表明连翘酯苷A可调节免疫细胞平衡，降低甲型流感病毒FM1株在小鼠肺脏中引起的炎性反应。此外，连翘酯苷A可减轻脂多糖诱导的肺损伤[8]。T淋巴细胞是免疫反应的中心环节，CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群之间比例失衡可导致免疫反应紊乱，从而引起炎性反应，造成组织损伤。IL-6是炎性反应中重要的炎性递质，IL-8是启动炎性反应的关键因子[9]。本研究结果显示宫内感染造成新生大鼠呼吸频率加快、肺指数降低，连翘酯苷A可减慢呼吸频率、升高肺指数。宫内感染后新生大鼠肺泡数量明显减少，且肺泡隔内可见大量炎性细胞浸润，连翘酯苷A治疗后少量炎性细胞浸润；孕鼠宫内感染造成新生大鼠肺组织中CD4+/CD8+降低，炎性因子IL-6、IL-8和IL-1β水平升高，连翘酯苷A治疗后CD4+/CD8+升高、炎性因子水平降低。此结果提示，连翘酯苷A可降低宫内感染新生大鼠炎性反应、改善免疫功能和肺损伤。

脂多糖作用于TRL4受体激活炎症下游信号通路，NF-κB即为其重要的靶点之一[10]。NF-κB是多种炎性因子基因的靶点，通常以p65/p50组成的异源二聚体形式存在于细胞质中，一般情况下不表现其活性，当细胞受到刺激时，抑制因子IKB发生磷酸化降解，NF-κB解离并活化进入细胞核，调节下游因子表达[11]。NLRP3炎性小体是固有免疫信号通路中重要的多蛋白炎性体，细胞受到刺激时被活化，活化后的NLRP3炎性体切割含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)-1，使其成熟后促进炎性因子前体(pro-IL-1β、IL-18)成熟活化，发挥其生物功能，而炎性因子前体的产生依赖于NF-κB的激活[12]。研究发现，在脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型中，肺组织p65、TLR4、NLRP3及caspase-1蛋白表达增加，肺组织损伤严重，而喘可治可减轻小鼠肺损伤，降低p65、TLR4、NLRP3及caspase-1蛋白在肺组织中的表达水平[13]。在脂多糖诱导的肺损伤小鼠模型中，脂多糖抑制TLR4/NF-κB p65信号通路激活及NLRP3炎性小体表达，降低氧化应激和炎性反应，改善肺功能障碍[14]。急性脓毒症大鼠肺组织中p65和TLR4蛋白表达升高，肺水肿明显，炎性因子水平升高，萝卜硫素可降低p65和TLR4表达，降低肺水肿程度[15]。本研究通过脂多糖激活TRL4受体，探讨连翘酯苷A是否通过该信号通路改善宫内感染新生大鼠肺损伤和免疫功能。结果显示，脂多糖上调宫内感染新生大鼠肺组织中TLR4、p-p65和NLRP3蛋白表达，而连翘酯苷A治疗后可抑制脂多糖的激活作用。此结果提示，连翘酯苷A可抑制TLR4/NF-κB p65/NLRP3信号通路激活。

综上所述，连翘酯苷A可改善宫内感染新生大鼠肺损伤及免疫功能，其可能是通过抑制TLR4/NF-κB p65/NLRP3信号通路激活发挥作用，为临床治疗肺支气管发育不良等疾病提供理论依据。