WE43镁合金骨植入对大鼠血液指标、脏器组织学的影响及其体内降解情况▲

张亚男 肖 鹏 孙 瑞 罗亚鸽 谢 文 冯 坤

[1 湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南省长沙市 410208； 2 河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)医学检验中心，河南省洛阳市 471002； 3 河南省正骨研究院，河南省骨科医疗器械工程技术研究中心，河南省洛阳市 471002]

生物可吸收镁合金具有可降解性、生物相容性、骨诱导性等优势，作为骨科医用材料被广泛应用于临床[1-3]。WE43镁合金具有良好的力学性能和易加工性，故具有应用于骨生物材料的价值[4-6]。目前有关WE43镁合金的研究主要集中在体外安全性评价试验、材料的降解性能和速率等方面，而有关WE43镁合金骨植入后在体内降解过程中的生物相容性研究并不多。本研究观察WE43镁合金骨植入对大鼠血液常规、肝肾功能的影响，以及WE43镁合金降解情况，从而探讨WE43镁合金在体内的生物相容性。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物 WE43镁合金采购自东莞市亿诺金属材料有限公司，元素含量为镁93.1%、3.8%钇、2.4%钕、0.5%锆、0.2%锌，用数控机床加工成直径约为2 mm、长度约为4 mm的镁合金圆柱形试样，尾部有直径0.9 mm、深度2 mm的小孔1个，清洁后干热灭菌备用。12只4月龄SD大鼠购自河南省实验动物中心[动物许可证号：SYXK(豫)2021-0009]，雌雄各半，单笼喂养，自由进食，饲养环境温度为20 ℃～26 ℃，湿度为50%～70%。根据随机数字表法随机分成对照组和镁合金植入组，每组6只，雌雄各半。

1.2 股骨髁骨缺损植入方法 饲养大鼠2周后进行手术。镁合金植入组大鼠术前禁食24 h。采用3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，剪毛备皮，进行股骨髁骨缺损植入手术。经皮暴露左右两侧股骨髁位置，骨膜下剥离显露骨质，垂直于骨干方向用电钻钻头钻出大小为2 mm×4 mm的骨缺损(见图1)； 把WE43镁合金试样植入大鼠的骨缺损处(见图2)，植入完毕后冲洗并缝合伤口；用碘附消毒，再用纱布包裹缝合部位，以防动物因疼痛而撕咬。术后给予庆大霉素肌内注射，2万U/d，1次/d，连续注射3 d。对照组大鼠不做任何处理。所有大鼠单笼饲养，自由进食，饲养环境温度为20 ℃～26 ℃，湿度为50%～70%。

图1 电钻钻孔

图2 WE43镁合金植入

1.3 观察指标

1.3.1 血常规、全血元素和肝肾功能指标的检测：术后6个月，采用3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射进行麻醉两组大鼠后取腹腔静脉血，留取全血2 mL并制备血清3 mL(以3 000 r/min离心7 min分离血清)，其中全血用于检测血常规和全血元素，血清用于检测肝、肾功能指标。血常规检测项目为白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积和血小板计数，采用XE-5000全自动血细胞分析仪(SYSMEX株式会社)进行检测，试剂盒均购自SYSMEX公司(批号：R0503、R0508、A0013、A0042、A0062)。全血元素包括镁、锌、钇、钕和锆，采用美国赛默飞公司ICAP-RQ型电感耦合等离子体质谱仪进行检测，所用的标准物均购自美国Inorganic Ventures公司(批号：N2-MG665351、N2-ZN664680、M2-Y02020R、N2-ND668817、M2-ZR663705)。肝功能检测指标包括AST、ALT和碱性磷酸酶，肾功能检测指标包括尿素氮、肌酐和尿酸，均采用LABOSPECT 008AS全自动生化分析仪(日立公司)进行检测，试剂盒均购自WAKO公司(批号：003046、910868、004087、004085、910868)。

1.3.2 组织病理学观察：采血后采用3%戊巴比妥钠(100 mg/kg)过量麻醉处死大鼠，取肝脏、肾脏和脾脏组织置于4%中性甲醛固定液48 h，然后进行冲洗、酒精梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，将切片烤干后进行脱蜡处理，之后顺序置入不同浓度的酒精中脱水3 min，使用苏木精染色5 min后流水清洗3次，使用盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗之后使用0.5%伊红液染色1～3 min，使用酒精进行脱水处理后进行脱蜡处理，使用中性树胶封固。使用Olympus-BX41显微镜进行观察与拍照，制片和染色试剂为罗恩AR纯试剂。

1.3.3 植入物降解情况及植入物周围成骨情况：取镁合金植入组大鼠左侧股骨髁进行Micro CT扫描。采用比利时Bruker公司的SkyScan 1174型CT仪，以12 μm扫描分辨率对植入物样本进行扫描。用N-Recon软件进行三维图像重建，用CT-AN软件进行三维分析，计算植入物体积和观察新骨生成情况。

1.4 实验质量控制 按照动物饲养的要求规定，在饲养的过程中，密切观察大鼠生长情况，避免大鼠生病或死亡，保证实验的顺利进行，并做好实验记录。 医学检验实验室已通过ISO15189实验室质量认证，并按要求做好相关质控。

1.5 统计学分析 将实验数据录入Excel软件，建立数据库。采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组大鼠血常规和肝肾功能指标的比较 两组大鼠血常规与肝肾功能指标比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

组别nALT(U/L)AST(U/L)碱性磷酸酶(U/L)尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)尿酸(μmol/L)对照组626.48±5.62144.41±54.1350.62±9.975.72±0.6138.51±9.69244.38±61.67镁合金植入组633.62±8.17146.40±37.2046.59±6.935.28±0.3239.29±2.87195.9±7.00 t值-1.767-0.0740.8131.565-0.1891.913P值0.3830.9620.6130.2930.8810.123正常参考范围38.67～117.23108.01～340.2741.4～137.52.96～12.7240.30～84.12—

2.2 两组大鼠全血金属元素含量的比较 镁合金植入组大鼠全血镁、锌含量略高于对照组，但两组间差异无统计学意义(均P>0.05)；两组大鼠全血中均未检出钇、钕、锆元素。见表2。

表2 两组大鼠全血金属元素含量的比较(x±s，mg/L)

2.3 两组大鼠脏器组织病理学的比较 镁合金植入组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞呈放射状排列，肝组织形态正常，无明显病理变化；肾小球体积正常，肾小管无明显病变，结构清晰，上皮细胞大小一致，无增生，肾组织结构无异常改变；脾脏组织结构正常，没有明显变化。两组大鼠脏器组织病理学比较无明显差异，见图3。

图3 两组大鼠的脏器组织病理学切片(HE染色，×100)

2.4 镁合金植入组大鼠植入物体内降解情况 Micro CT扫描结果显示，WE43镁合金植入物植入股骨髁内6个月后已发生体内降解，WE43镁合金植入物表面出现了明显的降解性缺损(图4A、图4B)，进一步分析发现WE43镁合金植入物周围有明显新骨质生成(图4C)；应用测量软件分析植入后的WE43镁合金植入物体积，植入前WE43镁合金植入物体积为(10.18±0.35)mm3，植入6个月后WE43镁合金植入物体积为(7.65±0.56)mm3，WE43镁合金植入物在大鼠体内降解丢失了约25%的原始体积。

图4 Micro CT扫描图

3 讨 论

WE43镁合金是目前研究较多的可降解骨生物材料之一，利用其体内降解性能制造出骨内固定器械，可以避免患者二次手术，并可降低医疗费用和手术风险[7-9]。血液检验是生物相容性研究的重要工作之一，血液指标的变化能够较好地反映外科植入物可能对机体造成的不良影响。血常规能够反映机体的生理、病理状态，是临床疾病诊断的主要检查项目。由于动物品种、检测仪器、试剂盒、实验方法及动物年龄等多个因素的影响，动物血液指标检验结果差异较大[10-11]。Tie等[12]将镁合金植入新西兰大白兔股骨内， 发现镁合金的降解过程对大白兔的血液学指标、心脏损伤和炎症发生情况、肝功能、代谢过程等均无明显影响。袁青领等[13]研究发现，将镁锌合金植入大鼠盲肠对其肝肾功能与电解质无明显影响，初步证实了镁锌合金的生物安全性。Wang等[14]将镁合金植入慢性肾功能衰竭大鼠模型，结果显示正常大鼠与慢性肾功能衰竭大鼠的血清、尿液、粪便和内脏中的镁含量均无明显变化，这提示镁合金植入也不会对肾功能衰竭大鼠造成额外的损伤。本研究中，镁合金骨植入组大鼠的血常规与肝肾功能指标虽然表现出部分变化，但与对照组大鼠比较均无统计学意义(均P>0.05)，且大部分结果均在参考范围内[15-21]，这提示WE43镁合金骨植入对大鼠血常规和肝肾功能指标的影响较小，与上述研究结果类似。

全血金属元素分析可以检测镁合金骨植入后在体内降解过程中释放入血中的金属离子浓度水平，用电感耦合等离子体质谱技术可以快速地分析血液中的痕量元素含量。镁和锌都是机体生存必需的元素之一，其中镁元素还是骨组织代谢的元素之一[22]。研究表明，镁合金有良好的骨诱导性,可促进骨折愈合[23]。本研究植入的WE43镁合金中含有一定含量的镁元素和锌元素，但植入6个月后，与对照组大鼠相比，镁合金植入组大鼠全血中的镁、锌元素含量并没有大幅升高，表明WE43镁合金骨植入对大鼠全血中金属元素含量水平影响较小，没有出现WE43镁合金降解后血液中金属元素含量显著升高的现象。分析原因可能为：植入物本身镁、锌的含量不高，WE43镁合金植入物的质量约为0.02 g,降解25%的释放量约为5 mg，降解过程为6个月，降解时间较长，血液中的金属元素含量少。此外，镁、锌元素可能随汗液、尿液、粪便排出体外，从而达到动态平衡。王义生等[24]认为镁离子降解后通过肾脏排出体外，且未对肾脏造成损害。本研究中未从大鼠血样中检出钇离子、钕离子和锆离子，可能为WE43镁合金在体内降解缓慢，而钇、钕、锆元素在合金中含量很低，降解后的离子被机体吸收后通过尿、粪排出体外，全血中钇、钕、锆元素含量水平低于设备检测线。

WE43镁合金可以在体内降解，降解产物须通过肝脏、肾脏等组织代谢排出体外，通过组织病理学观察可以直观地评估植入物降解可能对宿主器官产生的毒性损害。本研究结果显示，WE43镁合金骨植入6个月后，镁合金骨植入组大鼠的肝脏、肾脏和脾脏组织结构未发生明显异常改变，表明镁合金骨植入未对大鼠的肝脏、肾脏和脾脏造成明显的病理损害。Holweg等[25]观察镁合金接骨螺钉内固定用于绵羊骨折模型的效果，发现植入后12周绵羊的骨折完全愈合，认为植入物的降解过程不影响骨折愈合。Oshibe等[26]在大鼠胫骨中植入0.3 mm×10 mm的WE43镁合金柱体，在植入12个月时发现其体积损失为36%，植入物周围骨成熟，板层骨结构发育正常，这提示WE43镁合金植入物在骨组织中具有良好的长期稳定性和生物相容性。Byun等[27]采用Beagle犬截骨模型对WE43镁合金骨板和螺钉的性能进行评价，在植入4周时可观察到植入物发生降解，在植入24周时可观察到镁板被吸收，以及在镁板和螺钉周围形成的新骨。本研究的Micro CT扫描结果显示，在植入大鼠股骨髁内6个月后WE43镁合金植入物已发生明显的体内降解现象，其在大鼠体内降解丢失约25%的原始体积，进一步观察发现镁合金植入物周围有明显新骨质生成。这提示WE43镁合金骨植入后的体内降解可能有利于骨折修复，但是其具体机制仍需进一步研究。

综上所述，WE43镁合金骨植入未对大鼠的血常规、肝肾功能与全血金属元素含量造成明显影响，也未对大鼠的肝脏、肾脏和脾脏造成明显的病理损害，植入6个月后体内降解丢失约25%的原始体积，具有良好的组织相容性，可能有利于骨折修复。由于本研究样本量较少，观察时间较短，且为动物实验，WE43镁合金长期骨植入并在体内降解后的风险尚需进一步观察和评估。