脂肪甘油三酯脂肪酶在头颈部鳞状细胞癌中的表达及相关分子机制▲

肖 雪 言柯柯 李丽媚 赵 军 张 哲 周晓莹

(广西医科大学第一附属医院1 耳鼻咽喉头颈外科，2 放疗科，广西南宁市 530021； 3 广西医科大学口腔医学院-附属口腔医院儿童口腔科，广西南宁市 530021； 4 广西医科大学生命科学研究院，广西南宁市 530021)

GLOBOCAN2020数据显示，头颈部肿瘤是世界上第七高发的恶性肿瘤，2020年全球新发病例超过90万[1]。头颈部鳞状细胞癌(简称为头颈鳞癌)是发生于口腔、口咽、下咽、喉、鼻窦、唾液腺等解剖位置的恶性肿瘤，约占头颈部肿瘤的90%。由于头颈鳞癌的临床症状不典型，许多病例初诊时就已经处于晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)。尽管在过去的二三十年间肿瘤治疗手段飞速发展，但是头颈鳞癌患者的治疗效果仍不佳。如何寻找有效的诊断及预后评估的标记物，是当今头颈鳞癌研究的热点。

头颈鳞癌的发病危险因素有很多，包括经典的危险因素如吸烟、饮酒，以及近年来备受关注的人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)[2]。HPV相关性头颈鳞癌约占所有头颈鳞癌的25%，这类患者以青壮年人群为主，治疗效果通常较好，预后也好于HPV阴性患者[3]，但具体的原因和机制尚未完全阐明。

脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)，又称含Patatin样磷脂酶结构域蛋白3，是脂肪分解过程中的限速酶[4]。在前期研究中，我们发现鼻咽癌细胞通过表观遗传沉默UbcH8后下调ATGL的表达，导致脂滴堆积从而维持其恶性表型[5]。我们还报告了EB病毒编码的潜伏膜蛋白2A通过影响ATGL的表达从而抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为[6]。但是ATGL在头颈鳞癌中的表达及作用尚未见研究报告。因此，本研究分析ATGL在头颈鳞癌中的表达及与肿瘤预后的关系，并基于肿瘤免疫和表观遗传探讨相关分子机制，以及HPV感染通过调控ATGL表达对头颈鳞癌免疫微环境的影响。

1 资料与方法

1.1 ATGL在头颈鳞癌中转录水平和蛋白表达水平的分析 首先，通过UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)对ATGL在头颈鳞癌中的转录水平和蛋白表达水平进行分析[7]，其中转录水平分析纳入520例头颈鳞癌组织和44例头颈部非癌组织，蛋白表达水平分析纳入108例头颈鳞癌组织和71例头颈部非癌组织。另外，UALCAN数据库提供以“HPV感染状态”为分层因素的分析，因此本研究纳入80例HPV阳性和434例HPV阴性的头颈鳞癌组织，联合44例非癌组织，进行ATGL的转录水平分析。

随后，通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索ATGL微阵列数据集，纳入标准为：(1)包含肿瘤和非肿瘤分组；(2)肿瘤组为根据WHO标准[8]确诊为头颈鳞癌的患者；(3)每组病例数>3例；(4)可获得ATGL的数据。对入选的微阵列进行Meta分析以验证ATGL在头颈鳞癌中的转录水平。使用SPSS 22.0软件进行相关统计学分析，使用漏斗图和Begg′s检验进行发表偏倚评价，使用Cochran′sQ检验进行异质性分析，当P<0.05、I2>50%时被认为有异质性，此时使用随机效应模型进行分析。通过绘制森林图分析ATGL在头颈鳞癌中的表达情况，通过绘制漏斗图并进行Begg′s检验以评价和检验发表偏倚。以P<0.05视为差异具有统计学意义。

1.2 ATGL表达与头颈鳞癌分级和预后的关系 通过UALCAN数据库分析ATGL蛋白表达与头颈鳞癌肿瘤分级的关系。根据Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)绘制不同肿瘤分期(Ⅲ、Ⅵ期)头颈鳞癌患者和整体头颈鳞癌患者的生存曲线[9]，分析ATGL基因表达与生存情况的关系。

1.3 ATGL在头颈鳞癌中的DNA甲基化水平分析 通过MethSurv(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)分析ATGL CpG岛在头颈鳞癌中的甲基化状态，并评估ATGL CpG岛甲基化与头颈鳞癌患者预后的相关性[10]，预后评价指标为总体生存率。

1.4 ATGL相关信号传导通路的基因富集分析 通过基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)软件[11]，解析ATGL参与调控的信号通路。将基因集设置为“h.all.v7.5.1.symbols.gmt”，对TCGA数据库的头颈鳞癌基因表达谱数据进行富集分析，FDR<0.25，基因数量设置为≥35。

1.5 ATGL与头颈鳞癌中免疫细胞浸润的相关性分析 使用TIMER数据库(http://timer.cistrome.org/)分析ATGL基因表达与头颈鳞癌中免疫细胞浸润水平的相关性，分析在不同HPV感染状态下，ATGL基因表达与免疫细胞标志物的相关性[12]。

2 结 果

2.1 ATGL在头颈鳞癌中的转录水平和蛋白表达水平 通过UALCAN数据库进行分析发现，ATGL在头颈鳞癌组织中的转录水平低于头颈部非癌组织(P<0.01)，见图1。随后，纳入GEO数据库的21个数据集(表1)进行Meta分析，由于数据集之间存在异质性(I2=60.2%，P<0.001)，因此使用随机效应模型，分析结果显示ATGL在头颈鳞癌组织中的表达下调[SMD(95%CI)=-0.34(-0.58，-0.10)，P<0.05]，漏斗图提示数据没有发表偏倚(Begg′s检验P>0.05)，见图2。在蛋白表达水平方面，UALCAN数据平台分析结果提示ATGL在头颈鳞癌组织中的蛋白表达水平亦低于头颈部非癌组织(P<0.001)，见图1。

图1 ATGL在头颈鳞癌组织中的表达情况

表1 纳入数据集的基本信息

图2 ATGL在头颈鳞癌中转录水平的验证结果

2.2 ATGL表达与头颈鳞癌分级和预后的关系 对ATGL蛋白表达水平与头颈鳞癌肿瘤分级之间的关系进行分析，结果提示，与中分化(Grade 2)头颈鳞癌组织相比，低分化(Grade 3)头颈鳞癌组织中ATGL的蛋白表达更低(P<0.05)，见图3A。对78例Ⅲ期、259例Ⅳ期的头颈鳞癌患者中进行总体生存分析，结果提示ATGL高表达的患者的生存率更高(均P<0.05)，见图3B、图3C；对499例头颈鳞癌患者进行总体生存分析，结果提示ATGL低表达、ATGL高表达的头颈鳞癌患者的中位生存期分别为48.87个月、58.73个月，ATGL高表达者的总体生存率更高(P<0.05)，见图3D。

图3 ATGL表达与头颈鳞癌分级、分期和预后的关系

2.3 ATGL DNA甲基化与头颈鳞癌患者预后的相关性 MethSurv数据库中ATGL共有20个候选CpG岛位点，由于甲基化改变通常发生在CpG岛，因此我们对ATGL CpG岛的7个甲基化位点进行分析，结果提示共有3个位点的甲基化与患者的预后相关，分别为cg04519421、cg09051513和cg19713609(均P<0.05)，见表2。进一步分析发现与cg04519421、cg09051513位点未发生高甲基化的头颈鳞癌患者相比，发生高甲基化的头颈鳞癌患者生存率更低(均P<0.05)，预后更差；而与cg19713609位点未发生高甲基化的头颈鳞癌患者相比，发生高甲基化的头颈鳞癌患者的生存率更高(均P<0.05)。见图4。

表2 ATGL DNA甲基化对头颈鳞癌患者预后的相关性

图4 ATGL CpG位点cg04519421、cg09051513和cg19713609不同甲基化水平患者的生存曲线比较

2.4 ATGL相关信号传导通路的GSEA结果 最终纳入富集分数最高、同时满足P<0.05和FDR>0.25的15个信号通路，发现在头颈鳞癌中ATGL主要涉及转录因子E2F、DNA损伤检查点G2M、原癌基因MYC、蛋白分泌、上皮-间质转化、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Hedgehog、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，MTOR)、糖酵解等信号传导通路，见表3。ATGL的表达与这些信号通路的基因富集呈负相关，即头颈鳞癌可能通过下调ATGL来激活这一系列信号通路。

表3 ATGL参与调控的信号传导通路列表

2.5 ATGL表达与头颈鳞癌的肿瘤纯度及免疫细胞浸润相关性分析 结果显示，ATGL的基因表达水平与肿瘤纯度无相关性(r=0.038，P=0.394)，而与B淋巴细胞(r=0.215，P=2.09×10-6)、CD4+T淋巴细胞(r=0.246，P=4.61×10-8)及CD8+T淋巴细胞(r=0.124，P=6.75×10-3)、巨噬细胞(r=0.215，P=1.94×10-6)、中性粒细胞(r=0.230，P=3.50×10-7)及树突状细胞(r=0.243，P=6.38×10-8)等免疫细胞的浸润水平呈正相关，见图5。

图5 ATGL基因表达与头颈鳞癌的肿瘤纯度和免疫细胞浸润水平的相关性

2.6 HPV通过上调ATGL的表达影响头颈鳞癌免疫微环境 通过ULACAN数据库分析发现，与HPV阴性的头颈鳞癌组织相比，ATGL的转录水平在HPV阳性的头颈鳞癌组织中表达更高，见图6。基于此继续探索在HPV感染状态下ATGL对头颈鳞癌免疫微环境的影响，结果显示，与HPV阴性的头颈鳞癌组织相比，在HPV阳性的头颈鳞癌组织中ATGL基因表达水平与CD8+T淋巴细胞、T淋巴细胞(总)、B淋巴细胞、树突状细胞浸润水平的相关性更高，见表4。

图6 不同HPV感染状态的头颈鳞癌组织中的ATGL表达水平

表4 ATGL与免疫细胞标志物表达的相关性

3 讨 论

ATGL在肿瘤发生和发展中扮演了重要角色。ATGL具有肿瘤特异性，在不同的肿瘤类型中其表达情况也不同，例如，ATGL在乳腺癌、结肠癌、肝癌等组织中表达上调[13-15]，但在更多的肿瘤中，如肺癌、胰腺癌、平滑肌肉瘤，ATGL的转录水平呈现异常下调，并参与肿瘤进展的调控[16]。在本研究中，我们发现ATGL在头颈鳞癌中的转录水平下调(P<0.05)；与中分化头颈鳞癌相比，在低分化头颈鳞癌中ATGL蛋白的表达水平更低(P<0.05)；且ATGL基因表达水平越低，肿瘤Ⅲ期及Ⅳ期患者的生存率、头颈鳞癌患者的总体生存率均更低(P<0.05)。这表明ATGL低表达与头颈鳞癌的发生、发展及预后均有关。Qiao等[17]在一项病例对照研究中发现，外周血中ATGL的异常甲基化与早期肺癌，尤其是年轻女性罹患肺癌的发病风险密切相关。本研究的甲基化水平分析结果也提示ATGL CpG岛的3个位点的甲基化与患者的预后相关(P<0.05)，其中cg04519421、cg09051513位点发生高甲基化的头颈鳞癌患者生存率更低。结合甲基化水平分析结果，我们推测头颈鳞癌细胞可能通过表观遗传机制沉默ATGL的表达，以促进自身的恶性生物学行为，从而导致预后不良。

有学者提出，ATGL 通过氧化物酶增殖体激活受体α、炎症、氧化还原稳态及自噬等途径调控肿瘤的发生和发展[18]。而本研究结果提示，头颈鳞癌中ATGL主要涉及转录因子E2F、DNA损伤检查点G2M、原癌基因MYC、上皮-间质转化、TGF-β、Hedgehog、PI3K/AKT/MTOR、糖酵解等信号传导通路，表明上述通路均从不同层面或角度参与肿瘤的发生和发展，这也印证了我们提出的关于头颈鳞癌细胞通过下调ATGL从而激活肿瘤进程的假说。

肿瘤微环境由肿瘤细胞及其周围的免疫细胞、炎症细胞、成纤维细胞、微血管、细胞因子和趋化因子等构成[19]。在这个复杂的体系中，肿瘤细胞及其微环境相互影响，维持肿瘤细胞的恶性表型。本研究结果显示，头颈鳞癌中ATGL的表达与B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞等免疫细胞浸润程度呈正相关(P<0.05)。这提示头颈鳞癌细胞可能通过下调ATGL，以抑制免疫细胞的防御功能，从而发生免疫逃避，导致患者预后不良。

HPV也参与调控头颈鳞癌的免疫微环境。有研究报告，HPV调控头颈鳞癌肿瘤微环境中的体液免疫，从而导致HPV特异性B淋巴细胞反应的发生，并激活抗体分泌细胞和生发中心B淋巴细胞[20]。在HPV相关性头颈鳞癌中，CD8+T淋巴细胞占肿瘤浸润淋巴细胞的30%[21]。2021年，Eberhardt等[21]提出，HPV特异性PD-1+干细胞样CD8+T淋巴细胞具有很高的增殖潜能，对于维持肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞应答至关重要，靶向性调控这一细胞亚群可能可以通过利用局部免疫反应，从而改善患者的临床结局。在本研究中，我们发现与HPV阴性的头颈鳞癌组织相比，ATGL在HPV阳性的头颈鳞癌组织中的表达较更高，并与CD8+T淋巴细胞、T淋巴细胞(总)、B淋巴细胞、树突状细胞高浸润的相关性相对更强。由此可从HPV调控免疫重编程的角度切入，解释HPV阳性的头颈鳞癌患者临床治疗效果和预后较好的现象。

本研究从肿瘤免疫和表观遗传的角度，对ATGL在头颈鳞癌尤其是HPV相关性头颈鳞癌中的作用及相关机制进行了多维度的探索。结合研究结果，我们提出：ATGL是头颈鳞癌的抑癌基因，是候选的预后评估相关分子标志物；头颈鳞癌细胞可能通过表观遗传机制沉默ATGL的表达，从而促进自身的恶性生物学行为，同时抑制免疫细胞的防御功能以发生免疫逃避，由此导致不良预后；而HPV可介导ATGL高表达从而激活肿瘤微环境中的免疫应答，这是HPV相关性头颈部鳞状细胞癌患者治疗应答较好的可能机制。