基于网络药理学研究玉屏风散治疗慢性湿疹的作用机制

钟欣欣，王金华，查旭山

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

湿疹是由复杂的内外因素共同作用引起的一种有明显渗出倾向的皮肤炎症性疾病。慢性湿疹大部分是由于内外因素反复刺激或治疗不彻底反复发作形成，病程较长，症状以局部瘙痒为主，皮损表现为局部浸润肥厚、干燥、脱屑等[1]。治疗的主要目的是缓解瘙痒等症状、修复皮损和减少复发，提高患者生活质量[2]。西医目前多选用激素类、抗组胺类等药物治疗，此类药物容易引起不良反应，且较难完全根治慢性湿疹。中药治疗慢性湿疹疗效确切、不良反应少，且复发率低，但中药多为复方，其对慢性湿疹的治疗机制一直处于研究阶段。有研究显示，玉屏风散可明显提高治疗慢性湿疹的疗效[3-5]，因此笔者运用网络药理学的相关手段，研究了玉屏风散治疗慢性湿疹的作用机制，以期为临床用药提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 应用的数据库和软件：中药系统药理数据库和分析平台TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、GeneCards 数据库（https：//genecards.weiz-mann.ac.il/v3/）、Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）、VENNY 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）、STRING （https：//string-db.org/）、DAVID 6.8 （https：//david.ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.2.1软件。

1.2 玉屏风散药物对应成分的筛选及靶点预测 玉屏风散由黄芪、白术、防风组成，于TCMSP平台依次录入，获得相应成分化合物信息后参考文献方法依次以生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18为条件进行筛选[6-7]，得出各药对应有效成分化合物信息，同时进行文本挖掘，将筛选收集的化学成分作为药物潜在的活性成分并下载其对应靶点。

1.3 已知的疾病靶点检索 检索国际公认的GeneCards数据库，以“Chronic eczema”为关键词，检索已知的疾病靶点。

1.4 疾病－药物－成分－靶点网络的构建 将玉屏风散潜在靶点与慢性湿疹相关靶点均进行统一标准化命名（Uniprot数据库中的Genename行标准化命名），通过Excel表获得玉屏风散－慢性湿疹交集靶点，并于VENNY 2.1中绘制韦恩图。采用Cytoscape 3.2.1软件进行网络构建、可视化分析等。依据节点连接度（Degree）筛选出重要药效成分。

1.5 构建蛋白质相互关系网络 运用STRING平台，将筛选得到的交集靶蛋白导入，设置蛋白种类为“Homo sapiens（人类）”，设定置信度阈值≥0.7，默认设置其他参数，构建靶蛋白互作（PPI）网络模型。从而明确交集靶蛋白之间的联系，并依据Degree筛选出重要靶点。

1.6 基因功能注释（GO）生物过程与京都基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析 运用人类基因组注释数据库DAVID 6.8将得到的交集靶点进行GO生物过程和信号通路富集KEGG分析，并以P＜0.05为参数进行筛选，分析玉屏风散治疗慢性湿疹的主要生物过程及信号通路。

2 结果

2.1 玉屏风散活性成分筛选及靶点预测 在TCMSP数据库中，根据OB与DL阈值，剔除重复化合物与缺少靶点预测数据的化合物，最终共得出44个活性成分，其中白术7个、防风18个、黄芪20个。以S1～S44为序号对活性成分进行编号，见表1。对44个活性成分进一步预测，并将相同的靶点进行归一，结合Uniprot数据库确认并转换，最终得到180个靶点。

表1 玉屏风散活性成分筛选

2.2 慢性湿疹相关靶点数据构建 本研究检索国际公认的疾病基因相关数据库GeneCards数据库，并且挖掘前期文献已知的与慢性湿疹发生、发展密切相关的靶点，去重后共检索到1970个已知的靶点。

2.3 疾病－药物－成分－靶点网络的构建 将玉屏风散潜在靶点与慢性湿疹相关靶点导入Excel表进行分析，发现慢性湿疹与玉屏风散有83个交集靶点，并于VENNY 2.1中绘制韦恩图，见图1。将结果导入Cytoscape 3.2.1软件构建疾病－药物－成分－靶点可视化网络，见图2。在网络中，节点表示疾病、药物、化合物和靶标，连线表示其之间的相互作用。依据Degree筛选出排名前10位的重要药效成分，见表2。

表2 玉屏风散治疗慢性湿疹的药效成分（前10位）

图1 玉屏风散与慢性湿疹相关靶点韦恩图

图2 疾病－药物－成分－靶点网络图

2.4 构建PPI网络模型 依据Degree筛选出前20种PPI网络核心靶点并进行柱状图可视化，见图 3、4。

图3 玉屏风散作用于慢性湿疹潜在靶点之间PPI图片

图4 前20种PPI网络核心靶点柱状图

2.5 GO生物过程与KEGG信号通路富集分析 通过DAVID 6.8软件对获得的83个玉屏风散－慢性湿疹交集靶点进行富集分析，富集分析使用超几何分布设计算法，显著性P值的多重检验校正使用Benjamini-Hochberg校正方法。一共获取了122条生物过程，其中主要涉及机体多种反应，包括细胞因子受体结合、细胞因子活性、血红素结合、四吡咯结合、受体配体活性、核受体活性、转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA结合、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、辅因子结合、氧化还原酶活性，作用于成对的供体上，并结合或还原分子氧、铵离子结合、整联蛋白结合、生长因子受体结合、抗氧化活性、生长因子结合、过氧化物酶活性、类固醇激素受体活性、神经递质结合、氧化还原酶活性，以过氧化物为受体等生物过程。根据P值由小到大排列，对前20位进行柱状图可视化，见图5。

图5 玉屏风散潜在靶点治疗慢性湿疹GO分析柱状图（前20位）

玉屏风散治疗慢性湿疹潜在靶点富集的KEGG生物学通路主要有132条，包括糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体（AGERAGE）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、白细胞介素-17（IL-17）信号通路、恰加斯病（美国锥虫病）、甲型流感、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、蛋白聚糖、C型凝集素受体信号通路、松弛素信号通路、利什曼病、Toll样受体（TLR）信号通路、弓形虫病、辅助性T细胞17（Th17）细胞分化、耶尔森氏菌感染、破骨细胞分化、百日咳、前列腺癌、疟疾、膀胱癌等。对KEGG信号富集分析前20位结果进行可视化处理，见图6。

图6 玉屏风散治疗慢性湿疹潜在靶点KEGG分析的气泡图（前20位）

其中糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路上富集的基因最多，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路富集了21个基因，见图7；TNF信号通路富集了20个基因；IL-17信号通路富集了19个基因。另外，部分富集结果显示与糖尿病并发症、感染性疾病、癌症等信号通路相关，不除外玉屏风散可能多靶点多途径治疗糖尿病并发症、感染性疾病、癌症等疾病可能，可进一步研究其可能存在的药理作用。

图7 糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路图

3 讨论

玉屏风散由黄芪、白术、防风组成，君以黄芪补气升阳、固表止汗；臣以白术益气健脾、固表止汗；佐以防风祛风解表，全方共奏益气固表止汗之功。现代药理研究发现玉屏风散有免疫调节、抗炎、抑菌、稳定微生态环境及抗肿瘤等作用[8-11]。玉屏风散常用于治疗表虚不固且自汗恶风者，治疗慢性湿疹可改善皮肤腠理，并缓解瘙痒症状。湿疹病患多合并有免疫功能失调，故慢性湿疹有易复发特点，因此在治疗其临床症状的同时，还需对其免疫功能进行调理，而该方则能调节机体免疫功能及提高抗过敏能力，其主要原因可能是：黄芪、白术可通过作用于免疫系统的各个环节，来发挥调节机体免疫功能的作用[12-13]；防风则能阻滞过敏介质释放，抑制过敏反应的发生与发展，从而降低过敏反应的发生率[14]。本研究显示玉屏风散的多个活性成分可作用同一靶点，一个活性成分也可以影响多个靶点，从而验证了中药多成分、多靶点的特点。

网络药理学是基于“疾病－药物－成分－靶点”相互作用网络系统综合观察药物对疾病网络的干预与影响，将网络药理学应用于中医药学的研究进程中，在已知中药化学成分及疾病靶点的基础上，合理利用现有的研究成果，实现研究方式从“单靶点－单药物”模式到“网络靶点－多组分”模式的跨越[15]。经过网络药理学预测，发现玉屏风散治疗慢性湿疹的主要作用靶点是IL-6。Th1/Th2失衡是影响湿疹发生发展的重要因素之一[16]，在机体炎性反应发生发展、免疫反应调节、创面愈合等方面Th亚群功能失衡引起细胞因子分泌紊乱发挥着重要作用，Th1通过分泌 IL-2、干扰素-γ（IFN-γ）、IL-12 等细胞因子来介导细胞免疫；Th2通过分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子来介导体液免疫，二者可通过分泌细胞因子互相影响，Th2优势应答是慢性湿疹的特点[17]。有研究发现IL-6与免疫性疾病的发生、发展密切相关[18]。IL-6有复杂的生物学功能，在正常情况下调节免疫反应，而在病理状态下，其浓度的升高可引起免疫性的病理损伤[19]。本研究发现玉屏风散可能主要通过调节慢性湿疹患者的IL-6靶点来调节体内血清的IL-6水平，最终改善机体异常的炎性反应和免疫反应而发挥缓解和治疗作用。

玉屏风散治疗慢性湿疹潜在靶点富集的KEGG通路主要富集到糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等通路，研究发现AGEs-RAGE信号通路可以激活核转录因子-κB（NF-κB）引起大量黏附分子、生长因子、促炎细胞因子 （如IL-6、IL-8、TNF-α）等的表达和释放，导致细胞活化和组织损伤[20-21]；TNF信号通路可以通过调控体内的NF-κB及TNF等维持机体内的稳态来达到调节炎性反应的作用[22]；而IL-17信号通路可以调控上皮细胞产生促炎细胞因子、趋化因子和抗微生物肽诱导皮肤炎性反应[23]。所以玉屏风散可能是主要通过调控体内各种炎性反应、免疫相关因子来治疗慢性湿疹。

综上所述，玉屏风散治疗慢性湿疹有“多成分、多靶点、多通路”的作用特点，可为今后验证该药具体作用靶点和信号通路提供依据，节约有效资源，且有益于该药的二次开发。本研究仍存一定局限，如有效成分及相关靶点的确定方法可进一步优化，在今后的研究中可检测玉屏风散的入血成分来进行网络药理学研究，提高结果的可信程度。运用网络药理学研究玉屏风散治疗慢性湿疹作用靶点尚属预测，仍需要开展动物实验、细胞实验等证实这些靶点是否参与了玉屏风散对慢性湿疹的调控，以及是否主要通过以糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等通路发挥重要作用。