曲安奈德通过AMPK/mTOR信号通路对小鼠皮肤纤维化的自噬水平的调控作用

张小超，黄永初

（华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030）

皮肤纤维化是一种局限性或弥漫性皮肤纤维化结缔组织病变，常见的有瘢痕疙瘩、增生性瘢痕以及硬皮病等，有较高发病率，可累及心、肺、肾及消化道等内脏器官，引起多系统损害，给患者身体健康带来严重影响[1]。皮肤纤维化疾病发病机制复杂，目前尚无特效药物治疗，且已有的治疗手段治疗效果不一。因此探寻皮肤纤维化发生发展相关机制及有效治疗药物有较大临床意义。曲安奈德是一种人工合成的皮质类固醇类化学药物，有抗炎、免疫抑制等药理作用[2]。邓乐英等[3]研究显示，曲安奈德对瘢痕疙瘩有一定治疗作用，但具体机制尚未明确。研究表明，皮肤纤维化的发生发展与自噬关系密切[4]。何香等[5]研究显示，激活自噬可抑制博莱霉素诱导的皮肤纤维化进展。目前，有关曲安奈德对皮肤纤维化疾病（瘢痕疙瘩）的治疗作用是否与调控自噬有关尚少见报道，因此本研究探究曲安奈德对皮肤纤维化自噬的影响，并分析可能的机制，以期为临床有效治疗皮肤纤维化疾病提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 动物来源、主要材料与仪器 40只无特定病原体（SPF）级SD雄性大鼠（9周龄），体质量175～220 g，平均（201.26±18.37）g，购自北京唯尚立德生物科技有限公司，许可证为[SCXK（京）2016-0009]。

盐酸博莱霉素粉针剂，国药准字H2009088，购自上海梵态生物科技有限公司；曲安奈德，国药准字H20000454，购自西安杨森制药有限公司；兔抗鼠微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ（LC3-Ⅰ）、LC3-Ⅱ、家蚕隔离体蛋白 1（SQSTM1，又名 p62）、AMP 激活蛋白激酶（AMPK）、磷酸化 AMPK（p-AMPK）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR及β-肌动蛋白（βactin）多克隆抗体、山羊抗兔HRP二抗均购自上海钰博生物科技有限公司。

超速离心机（型号OptimaTMXPN）购自贝克曼库尔特生物科技有限公司；荧光倒置显微镜（型号CKX41-A32FL/PH）购自上海巴玖实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型建立 参照文献[6]进行，将40只大鼠随机分为对照组、模型组及曲安奈德低、高剂量组，每组10只。其中模型组及曲安奈德低、高剂量组小鼠采用博莱霉素皮下注射法建立皮肤纤维化模型：以生理盐水将盐酸博莱霉素粉针剂稀释为300 μg/mL的药液，将小鼠背部中央备皮并皮下注射博莱霉素30 μg/（kg·d），连续4周，观察各组小鼠于注射7 d、14 d、21 d、28 d时的一般情况，用药结束后小鼠局部皮肤变硬、难以捏起，说明小鼠皮肤纤维化模型建立成功；对照组于同时间背部皮下注射等量生理盐水。

1.2.2 给药方式 小鼠皮肤纤维化模型建立结束后，曲安奈德低、高剂量组小鼠分别腹腔注射20 g/L、80 g/（L·d）[7]，连续给药8周，对照组、模型组小鼠于同时间腹腔注射等量生理盐水。

1.2.3 标本采集 各组于给药结束后将小鼠处死，用无菌手术刀切取博莱霉素注射部位皮肤组织分为2部分，其中一部分制备组织切片用于HE染色；另一部分用于蛋白测定。组织标本磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后置于液氮中保存备用。

1.2.4 HE染色及皮肤组织厚度测定 取1.2.3各组小鼠部分皮肤组织，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（厚5 μm），行常规HE染色，于光学显微镜下测量小鼠皮肤组织厚度（包括真皮层、脂肪层）。

1.2.5 蛋白质印迹（WB）法 取1.2.3各组小鼠剩余皮肤组织，以放射免疫沉淀法裂解液（RIPA）裂解并提取总蛋白，检测浓度及纯度，行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜，放入脱脂奶粉（5%）溶液室温封闭2 h，分别加入一抗自噬相关蛋白（LC3、p62）、通路蛋白（AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR）及内参 β-actin，均为 1∶500 的稀释比，4 ℃过夜，加入 HRP标记山羊抗兔二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，显影、定影。以目标蛋白条带灰度值/内参条带灰度值来表示目标蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮肤外观观察结果比较 模型建立过程中：对照组小鼠于注射7 d、14 d、21 d、28 d均正常存活，且小鼠背部皮肤薄、颜色红润、可清晰观察到背部静脉血管，质地柔软，皮肤组织无黏连，小鼠精神状态较好；3组小鼠注射7 d皮肤颜色红润，而穿刺部位出现皮丘；注射14 d，皮肤颜色轻微变白、质地变化不明显；注射21 d，皮肤明显变白，周围血管模糊，质地变硬，与皮下组织黏连严重，且小鼠反应迟钝；注射28 d，皮肤变白且硬，周围血管无法识别，皮肤与皮下组织黏连严重，小鼠精神萎靡。

2.2 各组小鼠皮肤组织厚度比较 HE染色结果显示，与对照组比较，模型组小鼠皮肤真皮层明显增厚，胶原纤维增生、膨大明显，真皮下血管壁变粗、管腔变窄，皮下毛囊明显减少，脂肪层变薄且伴有较多炎性细胞浸润；与模型组比较，曲安奈德低、高剂量组小鼠上述皮肤组织病理学变化有所改善，有剂量依赖性。

给药治疗结束后，与对照组比较，模型组及曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织厚度升高（P<0.05）；但曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织厚度低于模型组（P<0.05），呈剂量依赖性。见图1、表1。

图1 各组小鼠皮肤组织厚度比较

表1 各组小鼠皮肤组织厚度比较 （μm，±s）

表1 各组小鼠皮肤组织厚度比较 （μm，±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与曲安奈德低剂量组比较，cP<0.05。

组别 n 皮肤组织厚度对照组 10 187.32±28.09模型组 10 436.77±65.53a曲安奈德低剂量组 10 325.69±48.86ab曲安奈德高剂量组 10 213.78±32.07abc

2.3 各组小鼠皮肤组织自噬蛋白水平比较 给药结束后，与对照组比较，模型组及曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，p62蛋白升高（均P<0.05）；但与模型组比较，曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，p62蛋白降低（均P<0.05），呈剂量依赖性。见图2、表2。

图2 各组小鼠皮肤组织自噬蛋白水平比较

表2 各组小鼠皮肤组织自噬蛋白水平比较 （%，±s）

表2 各组小鼠皮肤组织自噬蛋白水平比较 （%，±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与曲安奈德低剂量组比较，cP<0.05。

组别 n LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ p62蛋白对照组 10 1.36±0.21 0.50±0.07模型组 10 0.23±0.05a 1.45±0.21a曲安奈德低剂量组 10 0.69±0.13ab 1.03±0.15ab曲安奈德高剂量组 10 0.95±0.15abc 0.82±0.13abc

2.4 各组小鼠皮肤组织AMPK/mTOR通路蛋白水平比较 给药结束后，与对照组比较，模型组及曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织p-AMPK/AMPK降低，p-mTOR/mTOR升高（均 P<0.05）；但与模型组比较，曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织p-AMPK/AMPK升高，p-mTOR/mTOR降低（均P<0.05），呈剂量依赖性。见图3、表3。

表3 各组小鼠皮肤组织AMPK/mTOR通路蛋白水平比较 （%，±s）

表3 各组小鼠皮肤组织AMPK/mTOR通路蛋白水平比较 （%，±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与曲安奈德低剂量组比较，cP<0.05。

组别 n p-AMPK/AMPK p-mTOR/mTOR对照组 10 1.57±0.24 0.50±0.07模型组 10 0.45±0.07a 1.66±0.25a曲安奈德低剂量组 10 0.87±0.13ab 1.22±0.18ab曲安奈德高剂量组 10 1.26±0.19abc 0.90±0.13abc

图3 各组小鼠皮肤组织AMPK/mTOR通路蛋白水平比较

3 讨论

瘢痕疙瘩、增生性瘢痕以及硬皮病等均属于皮肤纤维化疾病，有相同特征如真皮内成纤维细胞过度增殖、胶原增多、细胞外基质的过度沉积等，目前，针对皮肤纤维化的治疗手段研究取得了一定进展，但效果均无法令人满意[8-9]。因此探寻简单有效治疗手段提高皮肤纤维化治疗效果已成为临床研究热点。曲安奈德是一种长效糖皮质激素，能抑制细胞免疫，减轻炎性反应及早期毛细血管的扩张，维持毛细血管通透性，能够通过抑制血管外基质的转换而诱导血管内皮细胞功能的改变，有持久抗炎、抗过敏作用，对各类皮肤病如神经性皮炎、湿疹、牛皮癣、疤痕疙瘩、肥厚性疤痕等[10-11]。王峰等[12]研究显示，曲安奈德对增生性瘢痕有较好的治疗作用。目前，曲安奈德对皮肤纤维化疾病的治疗作用具体机制尚未阐明。因此本研究建立皮肤纤维化小鼠模型，探究曲安奈德对皮肤纤维化小鼠的治疗作用并分析相关机制。

本研究结果显示，建模过程中，对照组小鼠于博莱霉素注射 7 d、14 d、21 d、28 d 均正常存活，且小鼠背部皮肤薄、颜色红润、可清晰观察到背部静脉血管，质地柔软，皮肤组织无黏连，小鼠精神状态较好；模型组及曲安奈德低、高剂量组小鼠分别死亡1只、2只、1只，3组小鼠注射7 d皮肤颜色红润，而穿刺部位出现皮丘；注射14 d，皮肤颜色轻微变白、质地变化不明显；注射21 d，皮肤明显变白，周围血管模糊，质地变硬，与皮下组织黏连严重，且小鼠反应迟钝；注射28 d，皮肤变白且硬，周围血管无法识别，皮肤与皮下组织黏连严重，小鼠精神萎靡。说明模型组及曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤纤维化模型建立成功，且不断加重。皮肤成纤维细胞功能障碍导致过多的胶原蛋白和其他基质成分在皮肤、血管积聚，使得皮肤厚度增加。本研究结果显示，与对照组比较，模型组及曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织厚度升高；但曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织厚度低于模型组，呈剂量依赖性。说明曲安奈德可能抑制皮肤纤维化进展。

研究表明，自噬与病理性瘢痕的发生发展有关。LC-3、p62是自噬形成过程的常用标志物，当自噬激活时LC-3可将多肽酶解，生成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ进而向LC3-Ⅱ转变是自噬小体形成的关键；P62是可被LC3-Ⅱ降解的自噬底物之一，用于评定自噬活性[13-14]。AMPK/mTOR通路是调控细胞自噬过程的主要通路之一，其中，AMPK经磷酸化反应后生成p-AMPK，p-AMPK进而抑制下游mTOR激酶信号发生磷酸化反应，最终诱导自噬发生[15-16]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组及曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK降低，p62蛋白及p-mTOR/mTOR升高；但曲安奈德低、高剂量组小鼠皮肤组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK升高，p62蛋白及p-mTOR/mTOR降低，呈剂量依赖性。说明曲安奈德可抑制小鼠皮肤纤维化进展可能与激活皮肤组织自噬有关。说明曲安奈德可能通过促进AMPK/mTOR通路活化激活皮肤组织自噬，进而抑制皮肤纤维化进展。

综上所述，曲安奈德能抑制皮肤纤维化进展，可能是通过促进AMPK/mTOR通路活化开启皮肤组织自噬实现的。然而本研究并未能明确曲安奈德对AMPK/mTOR通路的具体调控作用，后期应进行深入研究阐述。