miR-302b和CDK2在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及临床意义

胡怀远，汤衡

（1.皖北煤电集团总医院，安徽 宿州 234011；2.合肥安为康医学检验有限公司，安徽 宿州 230000）

皮肤恶性黑色素瘤是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，发病率逐年上升，已成为当今所有恶性肿瘤中增长率最高的肿瘤[1]。虽然医疗诊断技术进步，但仍有大部分患者在诊断时已发生转移，因而寻找新的有效治疗靶点具有重要意义。微小核糖核酸（microRNA）是一类非编码小分子RNAs，参与多种生命活动的调控，尤其在肿瘤的发生和进展中发挥作用。微小RNA-302b（miR-302b）是一种近年来发现的可参与细胞增殖进展的基因，在多种肿瘤的发生发展进程中发挥作用[2]，有研究表明，细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）与黑色素瘤的发生和进展有关，且CDK2是miR-302b的重要靶基因之一[3]。但二者在黑色素瘤患者表达关系中研究者甚少，因此本研究重点讨论黑色素瘤患者miR-302b与CDK2的表达及临床意义，以期为黑色素瘤的治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016—2020年97例皮肤恶性黑色素瘤患者与97例黑色素痣患者，均经病理学证实并对肿瘤切片进行包埋处理，其中皮肤恶性黑色素瘤患者组男42例，女55例，年龄30～70岁，平均（44.28±7.27）岁；黑色素瘤位于足部 20例、面部15例、躯干23例、头皮21例、生殖器18例。黑色素痣组男40例，女57例，年龄31～68岁，平均（43.58±8.12）岁；复合痣31例，皮内痣32例，交界痣34例。收集临床病理资料，包括肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、组织分化程度、浸润深度等。皮肤恶性黑色素瘤组患者按照国际抗癌联盟制定的分期标准[4]分为Ⅰ期13例、Ⅱ期33例、Ⅲ期25例、Ⅳ期26例。根据相关标准评估组织分化程度[4]：高分化25例、中分化39例、低分化33例。纳入标准：符合美国国立癌症综合网络（NCCN）指南有关黑色素瘤诊断标准[5]；可进行手术切除；均经病理组织学诊断标准确诊；入选前未进行任何放、化疗及靶向治疗。排除标准：结合其他部位恶性肿瘤；有活动性病毒或细菌感染者。

1.2 方法

1.2.1 实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR） 采用qRT-PCR法检测研究对象皮肤组织中miR-302b及CDK2 mRNA相对表达量。按照Trizol试剂盒说明书操作提取组织总核糖核酸（RNA），按照mRNA反转录试剂盒操作步骤将2 μg RNA反转录为cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix试剂说明配制反应体系并加样。qRT-PCR反应体系共为 20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，ddH2O 6.0 μL。完成后将其放入荧光定量PCR仪上进行反应，程序设定为：95℃30 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，共 40个循环，72 ℃10 min。miR-302b、CDK2 分别以 U6、GAPDH 为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计见表1。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算miR-200b、CDK2 mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 细胞培养 将人黑色素瘤细胞系A375置于10%及双抗胎牛血清培养基中，放置在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，当细胞将瓶底铺满后采用0.25%胰蛋白酶消化并传代，选择生长状态佳的对数期细胞计数后以每孔500 μL铺至96孔板中培养过夜。将细胞分为空白对照组（不作处理）、miR-302b组（转染合成miR-302b）、miR-302b阴性对照组（转染无意义序列）、CDK2组（转染合成CDK2）、CDK2阴性对照组（转染无意义序列），按分组将配置miRNA加入对应组别细胞，6 h后更换10%胎牛血清培养基。

1.2.3 MMT比色试验 转染细胞生长至80%后，采用PBS溶液冲洗2次，经胰蛋白酶处理制成单细胞悬液并计数，将细胞浓度调至2×104/mL，以每孔100 μL铺至96孔板，分别置于37℃、5%CO2培养箱中培养 12、24、48、72 h 后，加入 20 μL MTT（5 g/L）孵育4 h，吸除培养液加入1%二甲基亚砜（DMSO）150 μL，轻摇10 min使其溶解晶体。酶标仪设置为450 nm波长检测各组细胞吸光度，重复测量3次，取平均值计为各组细胞活性。

1.3 随访 所有病例均建立、健全随访制度，定期进行电话随访，随访时间为3年，并统计总生存时间（OS）即从随机化开始至任何原因引起的死亡。

1.4 统计学分析 采用统计学软件SPSS 17.0进行数据分析，计量资料符合正态分布的数据均以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用 t检验；计数资料用[n（%）]表示，组间比较采用 χ2检验；Pearson法进行相关性分析；采用Kaplan-Meier对皮肤恶性黑色素瘤患者3年的生存情况进行分析，各组数据均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组miR-302b和CDK2 mRNA表达水平的检测结果 黑色素痣组、黑色素瘤组miR-302b相对表达量分别为 1.02±0.15 和 0.38±0.06；CDK2 相对表达量分别为0.98±0.11和2.35±0.31。与黑色素痣组相比，黑色素瘤组miR-302b表达水平下降，CDK2 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 2组miR-302b和CDK2 mRNA表达水平比较

2.2 miR-302b、CDK2表达与黑色素瘤患者临床参数的关系 根据miR-302b表达水平的中位数值0.23分为高表达组共63例，低表达组共34例；CDK2表达水平的中位数值1.84分为高表达组61例，低表达组36例。观察miR-302b、CDK2表达与黑色素瘤患者临床参数的关系，结果显示miR-302b、CDK2均与淋巴结转移、临床分期、组织分化程度、浸润深度相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 miR-302b、CDK2表达与黑色素瘤患者临床参数的关系 例（%）

2.3 黑色素瘤组织中miR-302b和CDK2表达的相关性 Pearson相关性显示miR-302b与CDK2表达水平呈显著负相关（r=-0.769，P＜0.05），见图 2。

图2 miR-302b和CDK2表达水平的相关性分析

2.4 黑色素瘤组织中miR-302b、CDK2表达与患者预后的关系 Kaplan-Meier法分析显示miR-302b高表达组平均生存时间与总生存率高于低表达组（21.2个月 vs.18.6个月，73.5%vs.28.6%）；CDK2低表达组平均生存时间与总生存率高于高表达组（24.8个月vs.15.3个月，71.4%vs.23.0%），差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3。

图3 生存曲线

2.5 miR-302b、CDK2对黑色素瘤细胞活性影响 12 h各细胞活性比较差异无统计学意义（P＞0.05），而24、48、72 h各组细胞活性比较差异有统计学意义（P＜0.05）；其中与空白对照组比较，miR-302b组细胞活性均较低（P＜0.05），CDK2组细胞活性均较高（P＜0.05）；与miR-302b阴性对照组比较，miR-302b组细胞活性较低（P＜0.05）；与 CDK2阴性对照组比较，CDK2组细胞活性较高（P＜0.05）；miR-302b组细胞活性明显低于CDK2组（P＜0.05），见表3。

表3 miR-302b、CDK2对黑色素瘤细胞活性影响比较 （±s）

表3 miR-302b、CDK2对黑色素瘤细胞活性影响比较 （±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与 miR-302b 组比较，#P＜0.05；与 miR-302b 阴性对照组比较，△P＜0.05；与 CDK2 组比较，▲P＜0.05。

组别 12 h 24 h 48 h 72 h空白对照组 0.135±0.037 0.304±0.041 0.418±0.050 0.561±0.053 miR-302b 组 0.129±0.024 0.224±0.031* 0.235±0.037* 0.297±0.028*miR-302b 阴性对照组 0.131±0.017 0.318±0.039# 0.401±0.036# 0.574±0.046#CDK2 组 0.124±0.022 0.462±0.071*#△ 0.613±0.084*#△ 0.717±0.082*#△CDK2阴性对照组 0.131±0.026 0.324±0.045#▲ 0.422±0.043#▲ 0.0585±0.051#▲F 3.412 12.475 30.553 51.469 P 0.101 0.002 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

皮肤恶性黑色素瘤是一类起源于皮肤色素沉积的黑色细胞恶性肿瘤，恶性程度高、容易发生血管和淋巴结转移、复发率高、发展迅速、预后差、死亡率高[6]。目前临床主要以手术治疗为主，但仅对1期患者有效且复发率高。化学疗法也是临床常用方法，但只有极少部分患者对化学疗法敏感，达卡巴嗪作为治疗黑色素瘤的一线药物其治疗晚期患者的总存活时间仅为5.6～9.7个月。靶向治疗是近年来发展较为迅速的治疗方法，有针对性强的特点，因此研究皮肤恶性黑色素瘤靶向基因突变很有必要。有研究表明miR-302b、CDK2异常表达与多种肿瘤增殖密切相关，但关于miR-302b与CDK2在皮肤恶性黑色素瘤中表达及关系国内研究甚少，因此本研究重点探讨皮肤恶性黑色素瘤组织中miR-302b与CDK2表达水平、与患者临床病理参数的关系及在预后中发挥的作用，为临床治疗皮肤恶性黑色素瘤提供依据。

miR-302b属于miR-302基因簇，Zhang等[7]发现食管鳞状细胞癌中miR-302b表达下调，是不良预后的独立风险因子，且可通过靶向ErBb4抑制增殖和侵袭并促进凋亡。崔曼莉等[8]研究表明miR-302b在结肠癌中低表达。相关研究显示miR-302b在胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中发挥抑癌基因功能[9-12]。本研究中通过qRT-PCR检测发现皮肤恶性黑素瘤组织中miR-302b表达水平显著低于黑色素痣组织，与相关研究一致，说明miR-302b在皮肤恶性黑色素瘤组织中也发挥抑癌基因功能，参与其发生发展过程。根据miR-302b表达水平的中位数值将其分为高表达组与低表达组，观察miR-302b表达与患者临床病理参数的关系，结果显示miR-302b与淋巴结转移、临床分期、组织分化程度、浸润深度显著相关，其中高分化的组织中miR-302b的表达相对较高，中分化及低分化的癌组织中miR-302b的表达相对较低，而中/低分化的患者预后较差，临床分期中Ⅲ～Ⅳ期患者miR-302b的表达水平显著低于Ⅰ～Ⅱ期，提示miR-302b与恶性黑色素瘤浸润转移密切相关。因此miR-302b可以作为一个确定肿瘤分化程度和判断肿瘤预后的候选分子标志。同时本研究采用Kaplan-Meier法分析黑色素瘤组织中miR-302b表达与患者生存期的关系，结果显示miR-302b高表达组生存时间高于低表达组，说明miR-302b低表达时不利于黑色素瘤患者的预后，提示miR-302b可能在黑色素瘤的迁移过程中发挥重要作用，可通过下调表达而增强肿瘤细胞的转移能力进而对患者的预后产生不利影响[13]。

CDK2是CDK家族的关键成员，一种Ser/Thr蛋白激酶，编码298个氨基酸，相对分子质量为34，CDK2/细胞外调节蛋白激酶（EPK）信号通路对机体内细胞分化、组织修复等均有重要影响[14]，同时还可参与肿瘤细胞增殖、分化过程[15]。已有研究表明CDK2与黑色素瘤的发展和进展有关，CDK2在原发性和转移性黑色素瘤组织中呈现高表达，但正常的痣和原位黑色素瘤中表达正常[16]。酪氨酸激酶受体1（MEK1）是EPK信号通路中一种重要蛋白，MEK1磷酸可激活下游细胞周期蛋白和CDK形成复合物，促使细胞周期从G1期进入S期，通过激活信号通路促进细胞增殖[17]。本研究中通过qRT-PCR检测发现皮肤恶性黑素瘤组织中CDK2表达水平显著高于黑色素瘤组织，说明CDK2在皮肤恶性黑色素瘤组织中高表达，与黑色素瘤的发生及发展密切相关，与相关研究一致，提示CDK2在黑色素瘤的发展过程中可能发挥促癌基因的作用。根据CDK2表达水平的中位数值将其分为高表达组与低表达组，观察CDK2表达与患者临床病理参数的关系，结果显示CDK2与淋巴结转移、临床分期、组织分化程度、浸润深度显著相关，其中高分化的组织中CDK2的表达相对较低，中分化及低分化的癌组织中CDK2的表达相对较高，临床分期中Ⅲ～Ⅳ期患者CDK2的表达水平显著高于Ⅰ～Ⅱ期，表明CDK2的表达与肿瘤的恶性生物学行为有关，特别是与肿瘤的分化程度有密切的关系。Kaplan-Meier法分析显示CDK2低表达组生存时间高于高表达组，说明CDK2高表达时不利于黑色素瘤患者的预后。Liu等[18]在miR-302b在胃癌细胞调控中的分子机制研究中，通过双荧光素酶报告证实CDK2是miR-302b的靶基因，miR-302通过下调CDK2激活胃癌细胞EPK通路，进而促进胃癌细胞增殖。本研究分析显示与空白对照组比较，miR-302b组细胞活性均较低（P＜0.05），CDK2 组细胞活性均较高（P＜0.05）；miR-302b、CDK2呈负相关，猜测miR-302b通过抑制CDK2表达进而促进黑色素瘤细胞的生长及转移。

综上所述，miR-302b在黑色素瘤组织中低表达、CDK2在组织中高表达，二者呈负相关，且均与患者临床病理指标显著相关，可作为临床早期有效评估患者预后的重要指标。本研究存在一定不足之处，关于miR-302b、CDK2在黑色素瘤发生过程中相关机制有待进一步研究。